噪聲引起小型豬耳蝸炎癥復合體的激活及蛋白質(zhì)組學研究

塞娜 袁碩龍 郭維維 唐朝穎 張桐 趙偉豪 陳林軍 徐良慰 時晰張悅 邱仕偉 楊仕明 韓維舉

中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所聾病教育部重點實驗室，聾病防治北京市重點實驗室，軍事聲損傷防護實驗室（北京100853）

【關(guān)鍵字】噪聲性耳聾；炎癥復合體；蛋白質(zhì)組學iTRAQ；白介素-1β；NLRP3

噪聲引起的聽力損傷是多種因素綜合作用的結(jié)果，而損傷程度又因患者的年齡、易感性、噪聲的強度、接觸時間、頻譜特性的不同而有所差異。噪聲引起聽覺系統(tǒng)損傷機制包括機械損傷、耳蝸微循環(huán)損傷、代謝紊亂導致毛細胞死亡等，而噪聲損傷引起內(nèi)耳的免疫/炎癥可能是噪聲損傷的重要環(huán)節(jié)，近年來蛋白質(zhì)組學的發(fā)展使得我們有可能闡明耳蝸炎癥復合體在耳蝸噪聲損傷中的作用。同位素標記的相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）[1,2]是美國應用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）研發(fā)的一種多肽體外標記技術(shù)。該技術(shù)通過iTRAQ試劑特異性標記蛋白質(zhì)的氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈，而后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較多種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對/絕對含量?；谄潇`敏度高、重復性好、準確度高、高通量等優(yōu)勢[3]，目前已被廣泛應用于基礎(chǔ)和臨床研究的相關(guān)領(lǐng)域[4]。

小型豬的內(nèi)耳形態(tài)結(jié)構(gòu)與聽功能方面與人類具有高度相似性[5-6]。本研究采用iTRAQ技術(shù)研究小型豬耳蝸蛋白質(zhì)組在噪聲暴露前后的差異，并進行生物學分析，以揭示免疫和炎癥等因素對噪聲性聽力損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

標準化實驗用小型豬30只，體重5kg左右，性別不限，由涿州市康寧小型豬養(yǎng)殖有限公司提供，集中飼養(yǎng)于21-24℃、相對濕度50-80%的環(huán)境中。動物均無噪聲接觸史，未使用過耳毒性藥物，并且耳鏡檢查鼓膜正常。

1.2 小型豬穩(wěn)態(tài)噪聲性聾模型的建立

根據(jù)實驗目的不同將動物隨機分為正常對照組(n=10)，噪聲暴露后一天組(n=10)和噪聲暴露后七天組(n=10)。將清醒的小型豬置于50×30×25cm的籠內(nèi)，放置于密閉聲場，使用120dB(A)白噪聲連續(xù)暴露2天，每天3小時。

1.3 聽性腦干反應測試（Auditory brainstem response,ABR）

用速眠新Ⅱ0.25ml/kg+戊巴比妥鈉0.03g/kg肌肉注射復合麻醉動物。待其進入深度麻醉后，連接TDT電極。選擇短聲“Click”，短純音“tone burst”：設(shè)定頻率包括2kHz、4kHz、8kHz、16kHz、24kHz，聲音強度設(shè)定為為20-90dB SPL，按10dB SPL遞減，在接近聽閾時給聲遞減間隔為5dB SPL。同樣方法測試雙側(cè)耳。以能分辨出可重復的ABRⅤ波的最低刺激強度為閾值。具體電極連接方式及參數(shù)設(shè)置詳見既往文獻報道[7]。

1.4 同位素標記的相對和絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)

三組各隨機抽取3只動物，麻醉后迅速斷頭處死，取出雙側(cè)耳蝸后用PBS沖洗后迅速放入液氮中冷凍10min，之后置于-80℃冰箱保存。

iTRAQ實驗流程：

耳蝸樣品制備（提取蛋白）→SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)量→（樣品蛋白合格）胰蛋白酶Trypsin酶解→iTRAQ試劑標記分級→質(zhì)譜分析→軟件分析及統(tǒng)計學分析→生物信息學分析（GO分析、KEGGPathway）。

1.4.1 蛋白質(zhì)抽提及定量

用研缽將豬耳蝸研碎，蛋白質(zhì)提取及定量方法詳見既往文獻報道[8]。根據(jù)標準品繪制蛋白定量標準曲線，得到相關(guān)系數(shù)R2=0.9714＞0.95,認為蛋白量與OD吸光值有線性相關(guān)關(guān)系。12%的SDS-PAGE電泳測定總蛋白在14-100kDa分子量范圍內(nèi)得到一定的分離，三組樣本組內(nèi)的蛋白條帶具有相似的帶型。

1.4.2 蛋白樣品胰蛋白酶消化與iTRAQ試劑肽段標記

具體實驗方法見既往文獻報道[8]。iTRAQ試劑標記肽段：各組樣品肽段分別取約100μl，按照AB公司 iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit（AB SCIEX）試劑盒說明書進行肽段標記，不同樣品用不同大小的同位素標記，標記信息見表1。正常對照組行2次生物學重復（N1,N2），噪聲后一天組（NE1d-1,2,3）和七天組（NE7d-1,2,3)分別行3次生物學重復。

1.4.3 質(zhì)譜分析

毛細管高效液相色譜及質(zhì)譜鑒定方法詳見既往文獻報道[8]。每份樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive HF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)：質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW格式文件，用軟件Sequest和Proteome Discoverer進行搜庫定性及定量分析。

數(shù)據(jù)庫：uniprot_Sus.scrofa_160920.fasta

搜庫：搜庫時將RAW文件通過Proteome Discoverer提交至Sequest服務器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，然后進行數(shù)據(jù)庫搜索。

1.5 Western blot檢測

三組各隨機抽取3只動物，抽提蛋白及蛋白質(zhì)定量方法同前述。配置10ml的10%分離膠，4ml的5%濃縮膠濃度。待檢測蛋白樣品上樣量20μg/孔，濃縮膠恒壓80V，約30分鐘；分離膠恒壓120V，轉(zhuǎn)膜2小時。用5%BSA-TBST按1:1000稀釋一抗（山羊NLRP3多克隆抗體，兔Caspase-1多克隆抗體，兔IL-1β，小鼠NF-κB p65單克隆抗體，兔TNF-α多克隆抗體，小鼠β-actin單克隆抗體），4℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜5min×3次，加入5%脫脂奶粉-TBST稀釋的二抗，室溫孵育40分鐘,TBST洗膜，10min×3次。ECL 顯影、定影后，以目的蛋白/β-actin內(nèi)參蛋白灰度比較耳蝸中上述蛋白質(zhì)的表達量。

1.6 熒光實時定量PCR

擴增引物：NLRP3:Forward:5'-GACCTCAGCCAAGATGCAAG-3',Reverse:5'-TCTGATGCCCAGTCCAACAT-3';Caspase-1:Forward:5'-CCTCGAACTCT CCACAGGTT-3',Reverse:5'-GAAGACGCAGGCTTAACTGG-3';IL-1β:Forward:5'-CACACATGCTGAAGGCTCTC-3',Reverse:5'-GGGTGGGCGTGTTATCTTTC-3'; TNF-α:Forward: 5'-AAGGTCAACCTCCTCTCTGC-3',Reverse:5'-CCTCCCAGGTAGATGGGTTC-3';NF-κB:Forward:5'-TGCATCCACAGCTTCCAGAAC-3',Reverse:5'-CGCACAGCATTCAGGTCGTA-3';GAPDH:Forward:5'-TGGAAAGGCCATCACCATCT-3',Reverse:5'-ATGGTCGTGAAGACACCAGT-3'。使用Trizol試劑提取耳蝸中的總RNA。通過光譜測定RNA樣品的濃度和純度。使用實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行實時逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)。GADPH 作為內(nèi)參。2-△△CT方法對qRT-PCR的基因表達相對變化進行分析。CT值：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?！鳌鰿T=△CT(樣品A)-△CT（樣品B），△Ct(樣品X)=CT（樣品X,目的基因）-CT（樣品X，內(nèi)參基因）。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標準差（）表示。通過單因素方差分析分析比較三組之間的差異，兩組數(shù)據(jù)比較使用t檢驗。認為P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表1 樣本標記信息Table 1 Information of sample tag

2 結(jié)果

2.1 小型豬噪聲性聾模型聽力結(jié)果

所有實驗動物噪聲處理前均接受ABR測試，結(jié)果顯示30只正常小型豬ABR閾值為35.4±2.6 dB SPL。對三組動物進行ABR-click、tone burst測試，正常對照組小型豬10只（20耳）、噪聲后一天組小型豬10只（20耳）、噪聲后七天組小型豬10只（20耳），測試結(jié)果及統(tǒng)計分析詳見表2。用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，噪聲后一天內(nèi)平均聽閾提高到72.1±4.1dB SPL，在4k Hz處聽力損失最嚴重，高頻聽力損失較低頻嚴重；噪聲后七天平均聽閾可恢復至52.8±4.7dB SPL水平，4k Hz以上聽力損失恢復較低頻恢復稍差。

2.2 iTRAQ實驗結(jié)果

分級脫鹽合并后的6個fraction經(jīng)質(zhì)譜分析搜庫，結(jié)果以PSM FDR≤0.01，Protein FDR≤0.01篩選過濾，共鑒定到蛋白質(zhì)2158種，相對分子量集中在10-110kDa，蛋白質(zhì)標記效率：99.2%。

使用Proteome Discover蛋白質(zhì)組學分析軟件實現(xiàn)iTRAQ定量。根據(jù)定量結(jié)果，設(shè)定在1.2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）閾值條件下，進行差異蛋白篩選，F(xiàn)C≥1.2為上調(diào)，F(xiàn)C≤0.83為下調(diào)，0.83＜FC＜1.2認為表達量無明顯差異。結(jié)果噪聲暴露后較正常組具有顯著差異表達的蛋白質(zhì)共227個，噪聲后1天和7天組顯著差異蛋白有162個。樣品定量結(jié)果中大部分蛋白質(zhì)FC應接近1。運用頻數(shù)分布直方圖對iTRAQ定量數(shù)據(jù)進行分析，兩組樣本定量比值FC取Log2對數(shù)，見圖1。

圖1 蛋白定量比值分布直方圖Fig.1 Distribution of protein quantitative ratio histogram

2.3 生物信息學分析

2.3.1 Gene Ontology（GO）分析

通過搜索Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org）進行基因本體分析是生物信息領(lǐng)域中一個非常重要的方法和工具。通過建立一套具有動態(tài)形式的控制字集（controlled vocabulary），來解釋基因和蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)所發(fā)揮的作用，從而全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO注釋分析圖詳見圖2。

圖2 差異蛋白GO注釋圖Fig.2 GO annotations of differential proteins

表2 三組小型豬ABR閾值結(jié)果（dB SPL）Table 2 ABR threshold for three groups of miniature pigs(dB SPL)

GO總共有三個本體（Ontology）：

1）細胞組成（Cellular Component,CC）：是一個廣義的結(jié)構(gòu)對象，這可能是一個亞細胞結(jié)構(gòu)又或者是一個蛋白生產(chǎn)組件。本研究中，差異表達蛋白主要富集在細胞內(nèi)（Cell）和細胞器上（Organelle）。

2）分子功能(Molecular Function,MF)：描述生物活動，也表示一些具體的對象（分子或復合物）執(zhí)行的操作。本研究中，差異表達蛋白主要富集在蛋白結(jié)合（binding）和催化活性（catalytic activity）。其中富集在蛋白結(jié)合功能的相關(guān)蛋白包括：組蛋白H3，ATP合酶，Annexin，鳥苷酸結(jié)合蛋白等；富集在催化活性功能的蛋白包括：HTRA3，LTA4H,凋亡誘導因子（AIF）等。

3）生物過程（Biological Process,BP）：是一系列分子功能相互配合的事件，通常都有多個不同的步驟參與。本研究中，差異表達蛋白主要富集在細胞代謝過程（cellular metabolic process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）、免疫過程（immune system process）、信號轉(zhuǎn)導（signaling）、應激反應（response to stimulus）等生物學過程。其中富集在細胞代謝過程的蛋白包括：琥珀酸脫氫酶輔酶，NADH輔酶,異檸檬酸脫氫酶，ATP合酶，丙酮酸羧化酶等；富集在生物調(diào)節(jié)的蛋白包括：熱休克蛋白A1B,細胞色素C，鈣蛋白酶抑制素等；富集在免疫過程的蛋白包括：ASC,caspase-1，IL-1β,血管生成素，CD59等；富集在信號轉(zhuǎn)導的蛋白包括：NF-κB p65，TGF-β，趨化因子CCL21等；富集在應激反應的蛋白包括：ICAM-1，補體C3，CCL14等。

2.3.2 KEGG Pathway代謝通路注釋

在生物體內(nèi)，不同蛋白質(zhì)間相互影響、協(xié)同作用行使其生物學行為，KEGG Pathway是通過檢索有關(guān)信號通路（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）公共數(shù)據(jù)庫，分析基因或蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。差異蛋白的KEGG功能注釋，見圖3所示。本研究中，富集的KEGG pathway包括：阿爾茲海默病信號通路（Alzheimer's disease），MAPK信號通路（MAPK signaling pathway），吞噬體信號通路（Phagosome），氧化磷酸化通路（Oxidative phosphorylation)，帕金森病信號通路（Parkinson's Disease），亨廷頓病信號通路（Huntington's disease）等。

圖3 差異蛋白信號通路（KEGG pathway）注釋圖Fig.3 Annotated map of the KEGG pathway

2.4 噪聲刺激引起耳蝸炎癥復合體相關(guān)蛋白的變化

Western blot檢測正常對照組、噪聲后一天組和噪聲后七天組小型豬耳蝸蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)均有NLRP3,Caspase-1,IL-1β，NF-κB 和 TNF-α的表達，在噪聲暴露后一天組耳蝸中上述蛋白均發(fā)生顯著上調(diào)，而在噪聲暴露后七天組耳蝸中上述蛋白又有不同程度下調(diào)，但仍高于正常對照組，三組間灰度比值比較應用單因素方差分析，具體結(jié)果見圖4。

熒光實時定量PCR檢測對照組、噪聲后一天組、噪聲后七天組小型豬耳蝸的mRNA水平，NLRP3,Caspase-1,IL-1β，NF-κB 和TNF-α的mRNA水平變化趨勢與蛋白質(zhì)表達趨勢具有一致性，三組間2-△△CT比較使用單因素方差分析，具體結(jié)果見圖4。

圖4 噪聲刺激引起耳蝸炎癥復合體及相關(guān)蛋白的變化情況Fig.4 Changes of cochlea inflammasome-related proteins and mRNAlevels

3 討論

3.1 小型豬穩(wěn)態(tài)噪聲性聽力損傷特點

本研究利用120dB(A)白噪聲對小型豬進行連續(xù)噪聲暴露，首次成功構(gòu)建了小型豬穩(wěn)態(tài)噪聲性耳聾模型。小型豬是實驗動物中除靈長類外和人類進化關(guān)系最近的物種，但較靈長類來說不存在倫理問題，它與人類在基因、解剖及病理生理學方面十分相似，尤其是內(nèi)耳器官的結(jié)構(gòu)與人類極為接近,耳蝸鼓階尺寸與人類基本一致[5-6]。小型豬的耳蝸電生理測試與人類非常相似，ABR可以分化出七個波，以Ⅱ波和Ⅴ波最穩(wěn)定、重復率最高，且波形和潛伏期都與人類相近，而人的ABR以Ⅴ波最顯著，小鼠、大鼠、豚鼠等只能分化出Ⅰ-Ⅴ波，說明豬在整個聽覺傳導通路上的神經(jīng)核團與人類基本相似。

我們發(fā)現(xiàn)小型豬NIHL早期在4kHz聽力損失最嚴重，高頻聽力損失重于低頻，這一表現(xiàn)與人類NIHL基本一致。研究表明小型豬外耳道平均長度4.1cm[9]，與人類外耳道3cm接近，外耳道共振頻率都在3-4kHz，對噪聲中該頻率的聲音成分增益最大，因此對耳蝸的破壞力也最大。陳志婷等[7]用145dB SPL脈沖噪聲首次成功建立爆震性耳聾小型豬模型，發(fā)現(xiàn)50次以上的脈沖噪聲暴露后即刻可造成聽閾平均升高70dB SPL以上，這比本研究中穩(wěn)態(tài)噪聲暴露后平均聽閾上升38.4dB SPL高很多，說明脈沖噪聲對聽覺系統(tǒng)的破壞更嚴重；他們還發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后一周內(nèi)聽力恢復最快，第2-8周的聽閾基本穩(wěn)定，這與本研究中穩(wěn)態(tài)噪聲性聾模型聽閾改變趨勢相一致。此外，脈沖噪聲損傷后耳蝸中轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)Corti氏器結(jié)構(gòu)雖基本保持正常，但內(nèi)、外毛細胞均出現(xiàn)不同程度的缺失[5，7]，而在穩(wěn)態(tài)噪聲暴露后未觀察到耳蝸有內(nèi)毛細胞的明顯缺失，外毛細胞有部分缺失，以中、底轉(zhuǎn)為最重，這說明脈沖噪聲在損傷急性期對耳蝸的損傷以機械性損傷為主，而120dB(A)的穩(wěn)態(tài)噪聲對耳蝸的損傷主要以代謝性損傷為主。

3.2 噪聲刺激對小型豬內(nèi)耳影響的蛋白質(zhì)組學研究

強噪聲刺激后內(nèi)耳產(chǎn)生大量自由基，包括活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species,RNS）[10]，由于內(nèi)源性的抗氧化物酶不足以清除掉過量堆積的自由基，進而引起細胞脂質(zhì)過氧化以及DNA、蛋白質(zhì)、線粒體等結(jié)構(gòu)的損傷[11,13]本研究基于iTRAQ技術(shù)對正常對照組、噪聲暴露后一天組和七天組小型豬耳蝸篩選出有顯著性差異的蛋白質(zhì)進行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白質(zhì)主要富集在細胞代謝過程、生物調(diào)節(jié)、免疫/炎癥過程、信號轉(zhuǎn)導、防御應激反應等生物學過程。發(fā)現(xiàn)線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白琥珀酸脫氫酶輔酶、NADH輔酶、ATP合酶等蛋白質(zhì)在噪聲后發(fā)生差異表達，KEGG Pathway分析中發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化通路發(fā)生下調(diào)。眾所周知，氧化呼吸鏈是細胞內(nèi)ROS的最主要來源，而氧化磷酸化過程是ROS的重要去路，ROS以及噪聲暴露后耳蝸內(nèi)的缺血缺氧狀態(tài)又易損傷線粒體DNA(mtDNA)導致線粒體氧化磷酸化功能障礙，如此形成惡性循環(huán)，引起耳蝸內(nèi)活性氧自由基過量堆積。輔酶Q10可抑制線粒體脂質(zhì)過氧化、參與ROS的清除，F(xiàn)etoni等發(fā)現(xiàn)提高輔酶Q10的溶解性可有效抑制線粒體的過氧化，并減輕NIHL的聽力損失[10,16-17]。

噪聲暴露后5min即可觀察到耳蝸內(nèi)毛細胞損傷區(qū)域有且僅有凋亡發(fā)生，30min后可見凋亡和壞死同時存在[18]，說明NIHL早期毛細胞死亡方式主要是凋亡，而后期則壞死和凋亡同時存在[19]。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡誘導因子（AIF）在噪聲暴露后1天內(nèi)表達上調(diào)，可能是mtDNA損傷導致AIF自線粒體釋放后進入細胞核，通過依賴caspase-3通路或非依賴caspase-3通路誘導細胞凋亡[20]，也有報道表明在壞死和凋亡毛細胞中都有AIF的轉(zhuǎn)移[19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)噪聲損傷后耳蝸內(nèi)細胞色素C表達上調(diào)，進一步說明噪聲暴露導致的細胞缺氧、自由基損傷等破壞了線粒功能，使細胞色素C、AFI釋放，誘導細胞凋亡，最終造成細胞結(jié)構(gòu)破壞。

3.3 噪聲引起小型豬耳蝸炎癥復合體的激活

既往由于BLB這一解剖結(jié)構(gòu)的存在，使內(nèi)耳長期被認為是一“免疫豁免器官”，但晚近的多項研究證實內(nèi)耳自身具有很強的免疫能力。有研究對耳蝸感覺上皮進行高通量RNA測序，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后大部分表達變化的基因都與免疫和炎癥反應有關(guān)[21-22]，說明免疫/炎癥反應不僅是NIHL的重要機制，而且是噪聲刺激損傷耳蝸的主要反應。本研究著重篩選分析了噪聲暴露后耳蝸中免疫和炎癥相關(guān)的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后NF-κB和炎癥復合體相關(guān)蛋白ASC、caspase-1發(fā)生差異表達，提示噪聲損傷激活了NLRP3-炎癥復合體。未激活時NLRP3在細胞內(nèi)的表達量很低，一般認為，NLRP3-炎癥復合體的激活需要兩個信號：第一信號通過 ROS、TNF-α、IL-1 等結(jié)合 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）誘導NF-κB活化使得炎癥小體的關(guān)鍵蛋白NLRP3、pro-IL-18、pro-IL-1β表達上調(diào)[23-24]，而強噪聲暴露通過TLRs信號轉(zhuǎn)導通路激活免疫/炎癥反應已得到證實[25-26]，第二信號刺激NLRP3后借助ASC募集并剪切pro-caspase-1為有活性的caspase-1，促使下游的IL-1β和IL-18成熟并釋放或引發(fā)細胞焦亡（pyroptosis）[23]。我們推測噪聲損傷產(chǎn)生的第二信號包括：胞外ATP刺激誘導鉀離子通道開放、引起胞內(nèi)K+降低、Ca2+內(nèi)流，溶酶體酶釋放以及細胞內(nèi)ROS升高激活NLRP3，而目前研究認為ROS升高應該是炎癥復合體激活的主要原因[23]。促炎因子IL-1β可募集白細胞損傷神經(jīng)元，并導致NO、TNF-α和IL-6從小膠質(zhì)細胞中分泌，引起神經(jīng)毒性[27]。因此，NLRP3炎癥復合體及其下游因子IL-18、IL-1β可進一步促進炎癥因子如TNF-α和IL-6分泌，TNF-α和IL-6再通過結(jié)合TLRs激活NF-κB信號通路引發(fā)細胞凋亡、壞死，后者又能作為第一信號激活炎癥復合體，推測耳蝸內(nèi)可形成上述循環(huán)，加劇最初的炎癥反應。正常情況下，炎癥復合體作為機體固有免疫的一部分可防御外界細菌、病毒感染，維持自身穩(wěn)態(tài)，但當其活化失控，產(chǎn)生過度的炎癥反應就會發(fā)生疾病，如NLRP3基因突變會導致Muckle-Wells綜合征、家族性地中海熱等。研究發(fā)現(xiàn)有進行性感音神經(jīng)性聽力障礙的Muckle-Wells綜合征患者，經(jīng)過IL-1β抑制劑治療后大部分聽力都得到改善或穩(wěn)定[28]。

目前認為，NLRP3-炎癥復合體與阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD）、動脈粥樣硬化、糖尿病、帕金森?。≒arkinson's Disease，PD）等退行性疾病密切相關(guān)[29-30]，發(fā)現(xiàn)外源性的炎癥細胞因子可以改變血-腦屏障的通透性從而進入大腦[31]，也可以由病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)刺激直接在大腦中產(chǎn)生，應用IL-1阻滯劑后可促進神經(jīng)功能的愈合。本研究發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后差異表達蛋白KEGG pathway在AD、PD及亨廷頓病等信號通路有富集，提示NIHL可能與這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病在發(fā)生機制上有所重疊，氧化應激損傷在退行性疾病的作用已較為明確，而炎癥復合體激活可能是介導這些疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機制。老年性聾的耳蝸內(nèi)微血管發(fā)生退行性改變、微循環(huán)紊亂引起內(nèi)耳缺血缺氧，線粒體功能障礙釋放ROS，引起聽力損傷[30]，并且已有研究證實老年性小鼠通過ROS通路激活耳蝸內(nèi)NLRP3介導的炎癥復合體[32]，提示NIHL和年齡相關(guān)的退行性疾病也可能是依此途徑激活炎癥復合體進而推動疾病的進展。