采用液相色譜法檢測(cè)牛肉中五種磺胺類藥物

任 展 黃建林 郝建格

（四川省漢源縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)站，四川 漢源 625300）

農(nóng)質(zhì)發(fā)〔2014〕5號(hào)文件附件8《磺胺類藥物在動(dòng)物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測(cè)方法》指出該方法適用于豬肉中五種磺胺類藥物（磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧噠嗪、磺胺喹惡啉）殘留檢測(cè)，為探究該方法的適用范圍，本文在 方法定量限50μg/kg、最大殘留限100μg/kg、2倍最大殘留限200μg/kg三個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行三水平添加回收試驗(yàn)。采用多點(diǎn)溶劑外標(biāo)和相鄰濃度的基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)，并用相對(duì)響應(yīng)值法來(lái)評(píng)價(jià)兩種方式的定量結(jié)果差異，考查以牛肉為基質(zhì)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)和方法的定量限、正確度、精密度能否滿足 檢測(cè)方法和NY/T 1896-2010《獸藥殘留實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》的相關(guān)要求，以此評(píng)價(jià)能否運(yùn)用該方法對(duì)牛肉組織樣品中五種磺胺類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

本文的基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)方式為：基質(zhì)效應(yīng)（%）=B/A×100%，A:用溶劑標(biāo)校準(zhǔn)的回收量，B:用基質(zhì)標(biāo)校準(zhǔn)的回收量。 當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)為90% ～110%時(shí)，則認(rèn)為兩種校正方式不存在顯著差異，采用溶劑標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)；反之，則認(rèn)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有顯著影響，采用基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.試驗(yàn)方法

1.1 儀器、試劑和材料

儀器設(shè)備：Agilent 1260高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）、華志HZT-A300百分之一電子天平、鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、固相萃取裝置、蜀科TGL-17離心機(jī)、艾卡T18勻質(zhì)器。

試劑耗材：乙腈（色譜純）、 甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純）、冰乙酸（色譜純）、正丙醇（色譜純）、無(wú)水硫酸鈉（分析純）、電阻率為18.2MΩ的超純水、體積比為95+5乙腈-水、體積分?jǐn)?shù)70 %乙腈水溶液、CNWBOND堿性氧化鋁柱（2g/10mL）、津騰尼龍微孔濾膜和針頭過(guò)濾器（0.22μm）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所（天津）1mL、100μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺喹噁啉（SQ）、磺胺二甲氧噠嗪（SDM）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將所購(gòu)置的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液用甲醇稀釋配制為10μg/mL的磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20℃以下冰箱中保存，有效期3個(gè)月。

溶劑五點(diǎn)外標(biāo)：準(zhǔn)確吸取五種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、 5.0 μg/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，由低濃度到高濃度供液相色譜儀測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

單點(diǎn)基質(zhì)標(biāo)：平行稱取10個(gè)空白樣品，經(jīng)前處理后，得到約20mL混合基質(zhì)溶液。準(zhǔn)確吸取一定體積的5.0 μg/mL五種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用此基質(zhì)溶液稀釋成濃度為0.12μg/mL、0.25 μg/mL、0.5μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 前處理

提?。悍Q取牛肉組織樣品5（±0.05）g于50 mL塑料離心管中，加入15 mL乙腈和4 g無(wú)水硫酸鈉，以10000 r/min的速度均質(zhì)1 min后，用3000 r/min的速度離心5 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；再在下層殘?jiān)屑尤?5 mL乙腈，渦旋混勻1 min后，以3000 r/min速度離心5 min，合并兩次的上清液于同一離心管中，在此離心管中加10 mL正己烷，振蕩5 min后進(jìn)行離心分層，取下層液體至100 mL雞心瓶中，并加入5 mL正丙醇，在50 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加 95+5的乙腈-水3 mL，渦旋混合1 min，超聲2 min，作為備用液。

凈化：取 95+5的乙腈-水3 mL活化堿性氧化鋁小柱，將上述備用液倒入堿性氧化鋁柱中過(guò)柱，再用95+5的乙腈-水5 mL洗滌雞心瓶后過(guò)柱，不收集；小柱內(nèi)溶液完全流出后，用負(fù)壓抽干小柱；用10 mL 70%乙腈水溶液洗脫，收集洗脫液于100 mL雞心瓶中；加入正丙醇5 mL后，用50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入2.0 mL流動(dòng)相溶解，渦旋1 min超聲2 min，過(guò)0. 22 μm濾膜后，用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18，250mm×4.6mm（i.d.），粒徑5μm；

流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水-冰醋酸（2+2+9+0.2）；

流速：1 mL/min；

進(jìn)樣量：20 μL；

柱溫：30 ℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。

2.試驗(yàn)結(jié)果

從色譜圖可以看出（如圖1、2、3、4、5所示），樣品經(jīng)前處理后，在五種磺胺目標(biāo)物的出峰區(qū)域無(wú)干擾情況存在；五種磺胺類藥物的峰形尖銳、對(duì)稱性好、保留時(shí)間穩(wěn)定，所有物質(zhì)均能在17 min內(nèi)完全流出分離。

圖1 試劑空白色譜圖

通過(guò)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算，牛肉基質(zhì)對(duì)五種磺胺類藥物的響應(yīng)值影響不顯著，故使用溶劑標(biāo)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)，并在此校準(zhǔn)方式下對(duì)結(jié)果的正確度和精密度進(jìn)行計(jì)算。以五種磺胺類藥物的濃度（μg/mL，x）和相對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值（峰面積，y）進(jìn)行線性回歸，線性方程如表1所示，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。在定量限、最大殘留限量、2倍最大殘留限量濃度水平下的檢測(cè)結(jié)果如表2所示 ，五種磺胺類藥物回收率在 70.6%～87.0%之間、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.1%～8.8%之間，上述結(jié)果均符合此檢測(cè)方法和NY/T 1896-2010中正確度（70%～110%）和精密度（RSD ≤ 15%）的要求。

通過(guò)對(duì)方法的選擇性、基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、定量限、精密度和正確度方法特性的驗(yàn)證，表明該方法同樣適用于牛肉基質(zhì)中五種磺胺類藥物殘留的檢測(cè)。

圖2 空白樣品色譜圖

圖3 各組分濃度為0.25μg/mL的牛肉基質(zhì)配標(biāo)色譜圖

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3.注意事項(xiàng)

使用該方法對(duì)牛肉中五種磺胺類藥物進(jìn)行檢測(cè)屬于超出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍使用標(biāo)準(zhǔn)方法，根據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中允許方法偏離的規(guī)定，此種方式屬于允許偏離標(biāo)準(zhǔn)方法的范圍，但此方法偏離后應(yīng)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，編制偏離標(biāo)準(zhǔn)的作業(yè)指導(dǎo)書，經(jīng)審核批準(zhǔn)后方可使用。

試驗(yàn)中為保證回收率達(dá)到規(guī)定要求，在前處理過(guò)程中有幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)應(yīng)需注意，否則回收率將會(huì)受到嚴(yán)重影響。在旋蒸過(guò)程中應(yīng)注意對(duì)近干的控制，第一次旋蒸過(guò)干不利于磺胺類藥物的復(fù)溶，會(huì)導(dǎo)致回收率降低；上樣和洗脫時(shí)，應(yīng)控制溶液過(guò)柱的流速（1mL/min為佳），過(guò)快的流速會(huì)導(dǎo)致回收率降低；堿性氧化鋁柱的極性較強(qiáng)，在活化、上樣中應(yīng)嚴(yán)格控制各溶液中水分的比例，若水分比例過(guò)高，上樣過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致磺胺類藥物從柱中直接流走，導(dǎo)致部分藥物回收率過(guò)低甚至沒(méi)有回收。