花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片衰老的影響

王 芳, 彭云玲, 方永豐, 慕 平, 王 威

(甘肅農業(yè)大學 農學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070)

玉米(Zeamays)為中國3大糧食作物之一，是重要的飼料、工業(yè)加工原料和糧食作物，其產量和品質對保障糧食安全和人民生活具有舉足輕重的戰(zhàn)略作用[1]。但玉米是旱地作物中需水量最大，對水分脅迫很敏感的作物之一[2]，由于降雨不足，或降雨不均，或灌溉時間與玉米需水臨界期相錯位，導致玉米在其生育期中總會經受不同程度和不同方式的干旱脅迫。中國玉米大約2/3栽培在干旱、半干旱的丘陵、臺地或雨養(yǎng)地區(qū)，主要分布在華北，西北和內蒙等地區(qū)，常年受旱面積40%左右，一般減產30%[3]。這些地區(qū)光能資源豐富，晝夜溫差大，干物質積累多，是玉米生產的有利因素，但是這些地區(qū)干旱少雨，尤其是在玉米生育后期易遇干旱，導致玉米早衰，光合降低，最終減產[4-5]。持綠性是指在籽粒生理成熟期葉片因衰老進程延緩而保持綠色的特性，被認為是作物的理想農藝性狀。持綠型玉米由于其生育后期具有較高的綠葉面積，可以有效地防止早衰。玉米持綠型品種后期綠色葉片數(shù)和重量、葉面積指數(shù)、葉面積持續(xù)期等均優(yōu)于常規(guī)品種，具有較高的光合活性，較高的蛋白質、蔗糖及脂類含量，較低的纖維含量，其生物產量、籽粒產量和秸稈營養(yǎng)價值也較高，并且對病害、旱災、倒伏等不良的條件具有較強的抗性，是玉米品種的演進方向[6]。持綠性作為植物抗旱的重要性狀，國際上在作物研究中受到廣泛重視[7-8]。所以，研究玉米持綠特性和抗旱性，闡明持綠特性的抗旱機理，可為玉米育種提供新思路，也可為充分挖掘持綠型玉米的潛力和優(yōu)勢提供理論依據(jù)。目前，關于玉米持綠性的研究主要集中在表型描述、栽培生理、品種選育以及持綠遺傳特性等方面，但對于干旱脅迫下持綠型玉米的生理機理的研究卻鮮有報道。在干旱條件下，持綠性作物在籽粒灌漿期間，葉片仍能保持綠色并進行活躍的光合作用，表現(xiàn)出明顯的抗旱能力。因此，本試驗以持綠型玉米齊319和早衰型玉米B73為研究對象，通過對不同持綠型玉米在干旱條件下響應的生理機制的比較，探討不同持綠型玉米抗旱的生理機制差異，為促進作物持綠性狀的應用、指導作物抗旱改良工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

持綠玉米自交系齊319和早衰玉米自交系B73，由甘肅農業(yè)大學平涼玉米育種站提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試材培育 試驗采用大棚盆栽方式，于2015年在甘肅農業(yè)大學試驗基地進行。盆高30 cm，直徑33 cm，盆缽重1.2 kg。每盆裝土17.0 kg。試驗用土取自甘肅農業(yè)大學作物實訓園土壤。以優(yōu)質農家肥作種肥，與過篩風干土混勻后裝盆，每盆裝土15.0 kg，全磷0.26 g/kg，全鉀13.28 g/kg，堿解氮115.38 mg/kg，速效磷5.27 mg/kg，速效鉀105.30 mg/kg。播種時每盆施用種肥2.5 g，追拔節(jié)肥尿素3.0 g。種子經挑選，于2015年4月15日進行播種，栽培管理同一般生產田，于試驗材料開花后一周進行干旱試驗處理。

1.2.2 試驗處理 開花后一周用稱重法控制水分。以正常供水(土壤含水量達田間持水量的69%～75%)為對照，設置中度干旱(土壤含水量達田間持水量的50%～55%)處理，每個處理設5個重復，處理期間每天下午用稱重法定量補充水分以控制土壤含水量，處理7 d，處理后取玉米棒三葉，存放于-80 ℃超低溫冰箱中，備測。水分脅迫期間，若有雨，則將盆缽置于防雨棚內。

1.3 測定方法

1.3.1 生長指標的測定 ①根系數(shù)目和根長的測定。取5株長勢相對一致的玉米，用無離子水清洗干凈玉米根，根數(shù)用目測直接計數(shù)；最長根長用直尺直接測定取平均數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。 ②根系鮮重及地上部分鮮重的測定。取5株長勢相對一致的玉米，用無離子水洗凈后用吸水紙吸干其表面水分，自莖基部將根系剪下，用電子天平分別稱重，記錄數(shù)據(jù)。 ③根系干重及地上部分干重的測定。取5株長勢相對一致的玉米，將根從植株基部剪下，用無離子水清洗干凈玉米根和地上部分，放入烘箱，將溫度調至105 ℃，殺青1 h，然后80 ℃烘干至恒重，最后用電子天平稱量，記錄數(shù)據(jù)。 ④根冠比。根/冠(R/T)=根系鮮重(R)/地上部分鮮重(T)

1.3.2 生理指標的測定 SOD活性的測定采用NBT光化還原法[9]；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[10]；CAT(過氧化氫酶)活性的測定采用紫外分光光度法[10]；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定[9]；游離脯氨酸含量的測定采用茚三酮顯色法[9]；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[11]；氣體交換參數(shù)的測定采用美國LI-COR公司生產的LI-6400光合測定系統(tǒng)[12]，選擇晴朗無風天氣進行測定，采用循環(huán)式測量方法，測定光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)等指標。

1.3.3 葉片衰老指標的測定 綠葉數(shù)目的測定采取直接讀數(shù)的方法，有枯黃的部分按綠色面積占全面積的百分比計算[13]。依照此法讀出綠葉數(shù)目，并做記錄。

綠葉面積、葉片保綠度的測定：每次取5株長勢相對一致的玉米，采用系數(shù)法測定和計算：綠葉面積=葉長×葉寬×0.75[5]。葉片保綠度=(某一時期全株葉面積/開花期全株葉面積)×100%。

葉綠素含量的測定采用馮雙華等的[14]方法。葉綠素酶活性和蛋白水解酶活性測定參照薛暉等[13]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行繪圖，用SPSS 16.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米植株生長的影響

由表1可以看出，干旱脅迫下，不同持綠型玉米的地上鮮重干重、地下鮮重干重、根長、根冠比、根系數(shù)目均有所減少，但減少的幅度存在很大的差異。與對照相比，齊319和B73地上部分鮮重顯著下降，分別減少了36.8%和21.1%(p<0.05)，地下部分鮮重分別減少了26.1%和33.2%(p<0.05)，地上部分干重分別減少了20.2%和9.1%(p<0.05)，地下部分干重分別下降了32.0%和38.3%(p<0.05)。玉米齊319根系數(shù)目、根長和根冠比相對于對照分別下降了18.3%，26.1%和8.70%(p<0.05)，玉米B73相對于對照分別下降了26.9%，33.2%和10.5%(p<0.05)。多重比較結果表明，干旱脅迫下齊319和B73的生長均受到抑制，且持綠自交系齊319生長受抑制程度明顯低于早衰自交系B73，說明持綠型玉米在干旱脅迫下能保持較好的生理功能以滿足生長的需要。

表1 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米植株生長的影響

注：不同字母表示不同處理之間的差異達到5%的顯著水平。下同。

2.2 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片抗氧化酶活性的影響

由圖1可知，在花后正常供水條件下，兩自交系的POD活性差異不大，無顯著差異。在干旱脅迫下齊319和B73葉片的POD活性較對照都有顯著的增加，但幅度不同，齊319較對照增加了32.53%，B73較對照增加了12.79%。

干旱脅迫下兩玉米自交系葉片SOD活性差異顯著，齊319和B73與其對照相比葉片的SOD活性顯著增加，分別增加了18.84%和10.82%，齊319葉片的SOD活性增加幅度更大，兩者差異顯著。表明持綠型玉米齊319在干旱脅迫下有較高的SOD活性，能較好的清除活性氧對其葉片膜脂化的影響，從而提高其抗旱性?；ê笳９┧畻l件下齊319葉片CAT活性與B73無顯著差異，但在干旱脅迫下B73葉片CAT活性略有降低，較對照下降了4.02%，而齊319的葉片CAT活性則較對照顯著增加，增加了9.09%，兩者差異顯著。

2.3 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片MDA含量的影響

由圖2可知，正常供水條件下，齊319的葉片MDA含量要比B73低，干旱脅迫使兩玉米自交系的葉片MDA含量較對照都有顯著的增加，齊319較對照增加了14.23%，B73較對照增加了37.43%，B73的MDA含量增加幅度顯著大于齊319。說明齊319的膜脂過氧化程度輕，有一定忍受干旱的能力。

圖1 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片POD，SOD，CAT活性的影響

圖2 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片MDA含量的影響

2.4 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響

由圖3可知，齊319和B73葉片的脯氨酸含量在正常供水條件下無顯著差異，但在干旱脅迫下兩自交系葉片的脯氨酸含量均大幅度增加。與對照相比，B73葉片脯氨酸含量增加了43.67%，齊319葉片脯氨酸含量增加了57.95%，齊319的葉片脯氨酸含量增大幅度顯著大于B73，并且在干旱脅迫下其脯氨酸含量也顯著高于B73。在花后正常供水條件下，齊319葉片的可溶性糖含量顯著高于B73，在干旱脅迫條件下，齊319和B73葉片的可溶性糖含量較對照都有顯著的升高，齊319的葉片可溶性糖含量較對照增加了18.46%，B73的葉片可溶性糖含量較對照增加了34.09%，B73的可溶性糖含量增加幅度大于齊319，兩者差異顯著。

圖3 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響

2.5 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片葉綠素含量和光合參數(shù)的影響

由表2可知，花后干旱脅迫下，兩玉米自交系的葉綠素總含量均顯著減少(p<0.05)，其中齊319的葉綠素總含量較對照組降低了1.4%，B73的葉綠素總含量較對照組降低了2.5%；表明花后水分脅迫后齊319葉綠素總含量減少的幅度顯著低于B73(p<0.05)。干旱脅迫條件下齊319和B73的Gs均大幅度降低，齊319的Gs較對照降低23.08%，B73的Gs降低了62.5%。在正常供水條件下，齊319和B73的Pn無顯著差異，但在干旱脅迫條件下，齊319和B73的Pn較對照均有所下降，分別降低了24.79%和46.39%?；ê蟾珊得{迫使B73的Tr顯著下降，且較對照減小了64.68%，而齊319的Tr減小了32.19%，降低幅度遠小于B73，干旱脅迫對B73自交系Tr的影響要大于齊319。說明干旱脅迫下齊319有較大的蒸騰拉力來滿足作物對水分的吸收，從而減少其自身受到水分脅迫的傷害。

表2 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片葉綠素含量和氣體交換參數(shù)的影響

2.6 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片衰老的影響

如表3所示，花后干旱脅迫下，兩種玉米葉片綠葉面積均顯著降低(p<0.05)，其中齊319較對照減少了3.5%，B73較對照減少了11.5%?；ê蟾珊得{迫后，兩種玉米的葉片保綠度均顯著降低(p<0.05)，其中齊319較對照組降低了17.3%，B73較對照組降低了26.1%，表明花后水分脅迫后持綠型玉米齊319葉片保綠度減少的幅度顯著低于B73(p<0.05)?；ê蟾珊得{迫下，兩種不同玉米自交系的葉綠素酶活性均顯著增加(p<0.05)，其中齊319的葉綠素酶活性較對照上升了23.3%，B73的葉綠素酶活性較對照上升了27.8%，表明花后水分脅迫后齊319葉綠素酶活性增加的幅度顯著低于B73(p<0.05)。花后干旱脅迫下，兩種玉米的蛋白水解酶活性均顯著增加(p<0.05)，其中齊319較對照上升了20.3%，B73較對照上升了47.8%，表明花后水分脅迫后齊319蛋白水解酶活性增加的幅度顯著低于B73(p<0.05)。

表3 花后干旱脅迫對不同持綠型玉米葉片衰老的影響

3 討 論

SOD，CAT，POD是植物體內主要的抗氧化酶，植物在光合作用中不可避免的產生活性氧及其衍生物，這些活性氧可對植物正常的組織細胞結構和生理生化過程產生氧化損傷，導致植物組織與大分子結構的損傷，破壞正常的生理機能。但在植物體內抗氧化系統(tǒng)的清除作用下，活性氧的產生和清除可保持一個動態(tài)的平衡，而在脅迫環(huán)境下，活性氧的含量會增加，破壞了他們之間的動態(tài)平衡，所以脅迫條件下抗氧化物質的增量可反映植物抗逆能力的大小[15]。本研究表明，在干旱脅迫下持綠型玉米齊319和早衰型玉米B73的POD活性均大于正常供水條件，且齊319的POD活性顯著大于B73。說明持綠型玉米齊319的保護酶系統(tǒng)在干旱條件下能夠更有效的對植株進行生理調節(jié)，從而起到保護植株的作用。干旱脅迫下兩自交系玉米葉片SOD活性差異顯著，持綠型玉米齊319在干旱脅迫下有較高的SOD活性，能較好的清除活性氧對其葉片膜脂的影響。CAT是C3植物中H2O2清除的關鍵酶[16]，在本研究中，花后正常供水條件下齊319葉片CAT活性與B73無顯著差異，但在干旱脅迫下齊319葉片CAT活性顯著升高，這與孫彩霞等[17]對玉米葉片受水分脅迫影響的研究結果相似。

大量研究[18]表明，脂質過氧化能夠嚴重損傷植物的細胞膜系統(tǒng)，破壞葉綠體和線粒體的超微結構，導致葉綠體降解，光和酶等多種酶活性下降。MDA是細胞膜脂質過氧化的最終產物，MDA含量的高低反映了脂質過氧化作用的強弱程度。本研究結果表明，在正常供水條件下，齊319的葉片MDA含量要比B73的低，干旱脅迫使兩玉米自交系的葉片MDA含量較都有不同程度的增加，B73的MDA含量增加幅度明顯大于齊319。這說明持綠型玉米齊319的膜脂過氧化程度較輕，衰老緩慢，在干旱條件下也能維持相對較低的MDA含量，這與劉開昌等[19]在保綠型玉米葉片生理機理研究中MDA含量變化結果一致。干旱導致植物體內MDA含量增加，一種原因可能是細胞失水，脂膜結構受損，膜脂透性增加。王空軍等[20]也認為早衰玉米葉片膜脂過氧化產物MDA 積累較多，而持綠品種則相反，生育后期差異更加明顯。

滲透調節(jié)是植物在干旱脅迫條件下主動增加細胞溶質含量，降低植株水勢，保持細胞水勢以抵抗逆境的一種方式。脯氨酸是重要的滲透調節(jié)物質，其含量的增加可以提高細胞的抗逆能力，增加細胞對干旱環(huán)境的適應性。可溶性糖是植物干旱脅迫下，植物體內誘導的小分子溶質之一，參與滲透調節(jié)，其含量的多少對植物抵抗干旱有一定作用[21]。本試驗中，齊319和B73葉片的脯氨酸含量在正常供水條件下兩者差異較小，但干旱脅迫下兩玉米自交系葉片的脯氨酸含量均大量增加，齊319的葉片脯氨酸含量增大幅度顯著大于B73。表明在水分脅迫下，齊319的滲透調節(jié)能力較強，能夠增加大量的脯氨酸來增加水勢，使體內細胞不至于大量失水，從而提高了自身的抗旱性。這與高愛麗等[22]研究的水分脅迫下葉片滲透調節(jié)與抗旱性的關系相一致。在花后的正常供水條件下，齊319葉片的可溶性糖含量顯著高于B73，在干旱脅迫下齊319和B73葉片的可溶性糖含量都有不同程度的升高，而B73的可溶性糖含量增加幅度大于齊319，說明齊319受到的干旱影響小。逆境下植物體內可溶性糖含量增加的原因主要是大分子碳水化合物和蛋白質的分解加強，而合成受到抑制，抗旱性強的品種可溶性糖含量增加小于抗旱性弱的品種，玉米葉片在水分脅迫條件下可溶性糖含量增加有積極的意義，許多研究證實這與滲透調節(jié)有關。干旱脅迫可使玉米葉片內可溶性糖含量有不同程度的增加，也說明干旱脅迫下可溶性糖是降低滲透勢，維持細胞膨壓的重要滲透調節(jié)物質[23]。

大量研究[24]結果表明，作物在遭受水分脅迫后，其葉片光合速率(Pn)，蒸騰速率(Tr)和氣孔導度(Gs)下降，使作物的經濟產量受到影響。氣孔是氣體進出植物體的主要通道，光合作用需要的CO2和蒸騰作用釋放出的H2O都是通過氣孔進出植物體的，因此Gs的變化將對光合作用和蒸騰作用產生重要影響，進而影響植株的生長發(fā)育[25]。對不同玉米品種開花期的Gs測定結果表明，在干旱處理下，兩玉米品種的Gs都呈現(xiàn)了不同程度的下降。早衰玉米B73的Gs值相對于持綠型玉米齊319下降的程度更大。可見齊319的Gs受干旱脅迫影響小，并且在干旱脅迫下齊319的Gs顯著高于B73，這使齊319能獲得較多的CO2，從而保證了光合的進行，表現(xiàn)出對于干旱環(huán)境較好的適應性，由此可見，持綠型玉米在干旱脅迫條件下仍能保持相對較高的氣孔導度，說明其抗旱能力較強。前人研究表明，輕度或中度干旱引起葉片氣孔關閉，使羧化作用位點CO2濃度降低，影響羧化中心對CO2的吸收，從而導致凈光合速率Pn下降[26]。本研究結果表明，齊319和B73花后干旱處理下的Pn較對照都有所減少，且B73的Pn下降幅度大，可見干旱處理對B73Pn的影響顯著大于齊319，另外干旱處理下齊319Pn要顯著高于B73，說明干旱處理對齊319和B73的葉片的光合作用造成了一定的影響，但持綠性較好的齊319的Pn所受影響小，從而使齊319在干旱條件下能維持較高的光合能力，制造同化物來保持機體正常的生命活動。Tr是植株在一定時間內單位葉面積蒸騰的水量，較高的蒸騰速率對降低葉片溫度、避免熱害、延長葉片功能期、增強根系吸收能力有重要意義[13]。本試驗中，干旱脅迫對B73的Tr影響要大于齊319，花后干旱脅迫使B73的Tr大幅下降，而齊319的Tr較對照下降幅度較小，降低幅度遠小于B73。說明持綠型玉米齊319的Tr在水分脅迫下有一定的降低，但與衰老型玉米B73相比，仍有較大的蒸騰拉力來滿足作物對水分的吸收，從而減少其自身受到水分脅迫的傷害，較早衰型玉米有更強的抗旱性。這與張春林等[26]對干旱脅迫下不同玉米光合特性的研究結果相一致。

葉片衰老是一個受遺傳控制并高度調節(jié)的過程，也是一個由很多生理變化和分子事件組成的復雜過程。從表現(xiàn)上來講，葉片衰老最顯著的特征就是葉綠素的喪失，而葉綠素的降解與葉綠素酶的含量有著密切的關系；從內部來講，葉片衰老過程中蛋白質含量下降，而蛋白質的分解與蛋白水解酶有著明顯的正相關。所以在研究葉片衰老的過程中，葉綠素酶和蛋白水解酶的活性變化是探討干旱影響玉米葉片持綠性的重要指標[13]。本試驗表明干旱脅迫下持綠型玉米齊319的葉綠素含量均明顯高于早衰玉米B73，且在干旱脅迫下，齊319的葉綠素含量的下降幅度均顯著低于B73，而葉綠素酶的活性以及蛋白水解酶的活性均明顯表現(xiàn)為齊319高于B73。而在干旱脅迫下，齊319的葉綠素酶及蛋白水解酶的活性升高幅度均顯著低于B73，表明在干旱脅迫下持綠型玉米的葉綠素及蛋白質的降解速率明顯低于早衰型玉米，干旱條件容易引起植物葉片的退綠，植物的持綠性可以阻止葉綠素降解。

4 結 論

在干旱脅迫條件下，持綠型玉米齊319葉片具有較強的SOD，CAT，POD 活性，B73玉米葉片抗氧化酶活性則相對較低。持綠型玉米在干旱脅迫下其葉片的活性氧調節(jié)能力較強，膜脂氧化程度較低，并且在生育后期保護性酶的活性降幅也小，體現(xiàn)了較好的抗旱性和持綠性。在干旱脅迫下，持綠型玉米齊319的MDA含量較B73低，并且在水分脅迫下其增幅小于B73，抑制了葉片相對質膜透性，增強持綠型玉米植株的耐旱能力。持綠型玉米齊319在干旱脅迫條件下，游離脯氨酸含量的增加幅度明顯大于B73，有利于增強其抗旱能力。干旱脅迫使玉米葉片Pn，Gs及Tr等光合指標下降，而抗旱性較強的持綠型玉米齊319光合指標下降幅度要小于抗性差的玉米品種B73。綜上所述，持綠型玉米齊319在干旱脅迫條件下，抗氧化酶活力強，MDA量積累少，脯氨酸增量顯著，葉片Pn，Gs及Tr等光合指標下降緩慢，抗旱性強。