Smac/DIABLO在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及促凋亡機(jī)制

王曉華 張玉娟

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科（河北承德 067000）

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率逐年上升，呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)［1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多基因調(diào)控異常的過(guò)程，尋找與其密切相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物，對(duì)內(nèi)膜癌患者進(jìn)行早期診斷、早期治療，成為婦科腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Smac/DIABLO又稱為低等電位點(diǎn)的凋亡抑制蛋白的直接結(jié)合蛋白，位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂，由7個(gè)外顯子組成。目前研究發(fā)現(xiàn)［2-5]Smac/DIABLO的表達(dá)和多種腫瘤的進(jìn)展呈明顯負(fù)相關(guān)，而Smac/DIABLO在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)Smac/DIABLO在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，研究Smac/DIABLO在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，并通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO的Ishikawa細(xì)胞模型，檢測(cè)相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的表達(dá)，探討Smac/DIABLO在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2014年12月至2016年3月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者新鮮內(nèi)膜組織共46例，依據(jù)手術(shù)病理分期（FIGO，2009年）其中Ⅰ期28例、Ⅱ期12例、Ⅲ期6例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，高分化34例、中分化8例、低分化4例，均獲得病理學(xué)確診為子宮內(nèi)膜樣腺癌。同期收集新鮮正常內(nèi)膜組織30例，非典型增生內(nèi)膜組織24例。標(biāo)本離體后迅速放入液氮中，再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存?；颊吣挲g為40～65歲，平均（55.2±6.7）歲，術(shù)前均未接受放化療及激素治療。所有標(biāo)本收集均經(jīng)倫理委員會(huì)同意，簽署患者知情同意書(shū)。

1.2 主要材料及試劑子宮內(nèi)膜高分化腺癌Ishikawa細(xì)胞購(gòu)自南京凱基公司，胎牛血清（FBS）、PRMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物公司，Smac/DIABLO、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9兔單克隆抗體，β-actin鼠多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)Smac/DIABLO mRNA表達(dá)Triol法提取各組總RNA，以1μL RNA為模板，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第1條鏈，應(yīng)用熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。Smac/DIABLO和GAPDH引物序列由大連寶生物公司設(shè)計(jì)合成，Smac/DIABLO上游引物序列5′-CGCAGATCAGGCCTCTATAACC-3′，下游 5′-CCCCTTCCTCCTGTGTTTTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物149 bp；GAPDH上游引物序列 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物 138 bp。反應(yīng)條件：95℃ 3 min 1循環(huán)，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃30 s共35循環(huán)。用2-△△ct方法計(jì)算目的基因Smac/DIABLOmRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染Smac/DIABLO的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Smac和空載體對(duì)照質(zhì)粒由蘇州吉瑪公司構(gòu)建。Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞均勻接種于6孔板，密度為4×105個(gè)/mL。按Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染試劑。實(shí)驗(yàn)分為過(guò)表達(dá)組、空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Smac過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，空載體對(duì)照組轉(zhuǎn)染Smac空載體對(duì)照質(zhì)粒，空白對(duì)照組加入10%FBS。轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.5 Western blot檢測(cè)Smac/DIABLO、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染后48 h，將細(xì)胞加入RIPA充分裂解后離心，取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量。蛋白變性后取40μg進(jìn)行凝膠電泳，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（1∶1 000）4℃過(guò)夜，二抗（1∶3 000）孵育1 h。ECL超敏化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Tanon 6100化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像并進(jìn)行定量分析，目的蛋白Smac/DIABLO與內(nèi)參蛋白β-actin的光密度比值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，采用單因素方差分析和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較釆用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Smac/DIABLO mRNA表達(dá)3組患者年齡、血壓和體質(zhì)指數(shù)比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。子宮內(nèi)膜癌組、非典型增生組和正常內(nèi)膜組，Smac/DIABLO mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.325±0.024、0.792±0.064、1.000±0.000，子宮內(nèi)膜癌組Smac/DIABLO mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于非典型增生組和正常內(nèi)膜組，經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=162.493，P=0.007）。

2.2 Smac/DIABLO mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系子宮內(nèi)膜癌組織中Smac/DIABLO mRNA的表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肌層浸潤(rùn)深度有關(guān)（P＜0.05），與年齡、組織分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。FIGO分期越高、肌層浸潤(rùn)程度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性，Smac/DIABLOmRNA表達(dá)量越低。見(jiàn)表1。

表1 Smac/DIABLOmRNA的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between Smac/DIABLOmRNAexpression and clinicopathological parameters of endometrial±s

表1 Smac/DIABLOmRNA的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between Smac/DIABLOmRNAexpression and clinicopathological parameters of endometrial±s

參數(shù)年齡（歲）≤60＞60肌層浸潤(rùn)深度＜1/2≥1/2組織分化程度高分化中+低分化FIGO分期Ⅰ+ⅡⅢ淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 無(wú)例數(shù)34 12 32 14 38 8 40 6 8 3 8 Smac/DIABLOmRNA相對(duì)表達(dá)量0.314±0.012 0.336±0.016 0.392±0.009 0.227±0.011 0.368±0.013 0.398±0.015 0.296±0.004 0.215±0.007 0.194±0.006 0.324±0.011 t值0.382 1.425 0.576 1.798 5.623 P值0.625 0.023 0.814 0.006 0.018

2.3 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)弱不等的綠色熒光，分別拍攝同一明暗視野下的細(xì)胞圖片，根據(jù)轉(zhuǎn)染效率（%）=暗視野綠色熒光細(xì)胞數(shù)/明視野細(xì)胞數(shù)，計(jì)算得出轉(zhuǎn)染效率約為80%。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖（×200）Fig.1 Cell transfection map（× 200）

2.4 轉(zhuǎn)染后Smac/DIABLO蛋白表達(dá)過(guò)表達(dá)組、空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組Smac/DIABLO蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.628±0.011、0.264±0.007、0.242±0.004，過(guò)表達(dá)組Smac/DIABLO蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加，經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.628，P=0.008）。說(shuō)明轉(zhuǎn)染Smac/DIABLO過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，可增強(qiáng)Smac/DIABLO在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn)染后相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9表達(dá)過(guò)表達(dá)組Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯增加，經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＞0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組Caspase-3,7,9蛋白條帶圖Fig.2 Caspase-3,7,9 protein bands in each group after transfection

表2 轉(zhuǎn)染后各組Caspase-3，7，9蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The relative expression of Caspase-3，7，9 protein in each group after transfection（n=6）±s

表2 轉(zhuǎn)染后各組Caspase-3，7，9蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The relative expression of Caspase-3，7，9 protein in each group after transfection（n=6）±s

組別過(guò)表達(dá)組空載體對(duì)照組空白對(duì)照組F值P值Caspase-3 0.664±0.012 0.375±0.007 0.392±0.004 42.640 0.006 Caspase-7 0.428±0.005 0.247±0.003 0.269±0.007 108.452 0.002 Caspase-9 1.228±0.027 0.824±0.012 0.896±0.016 179.265 0.018

3 討論

人類(lèi)Smac/DIABLO基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。XUE等［6]研究發(fā)現(xiàn)，Smac/DIABLO在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于乳腺纖維瘤組織。THORSTEN等［7]研究發(fā)現(xiàn)，Smac/DIABLO在膀胱癌患者中的表達(dá)僅為正常人的1/2，并且Smac/DIABLO高表達(dá)組患者的五年生存率明顯高于低表達(dá)組。同樣Smac/DIABLO在腎癌［8]、胰腺癌［9]、卵巢癌［10]中的表達(dá)量較正常組織均明顯減低。本研究發(fā)現(xiàn)，Smac/DIABLO mRNA在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)明顯低于非典型增生組和正常內(nèi)膜組（P＜0.01）。Smac/DIABLO在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肌層浸潤(rùn)深度有關(guān)（P＜0.05），F(xiàn)IGO分期越高、肌層浸潤(rùn)程度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性，Smac/DIABLOmRNA表達(dá)量越低，與年齡和組織分化程度無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡受阻有關(guān)，細(xì)胞凋亡受阻有利于轉(zhuǎn)化突變的細(xì)胞發(fā)生積聚性生長(zhǎng)，使細(xì)胞生存期延長(zhǎng)［11]。細(xì)胞凋亡存在內(nèi)源性和外源性兩條通路，分別稱為線粒體介導(dǎo)通路和死亡受體介導(dǎo)通路。含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteine aspartic acic specitic protease，Caspase）家族作為細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，在不同的凋亡通路發(fā)揮作用。其中Caspase-3和Caspase-7是線粒體介導(dǎo)通路和死亡受體介導(dǎo)通路共同的天冬氨酸特異性蛋白酶，Caspase-9是線粒體介導(dǎo)通路的始動(dòng)因子［12]。Smac/DIABLO可與凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)（baculoviral IAP repeat，BIR）結(jié)合，消除 IAPs對(duì) Caspase的抑制作用，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用［13-14]。本研究應(yīng)用脂質(zhì)體法將Smac/DIABLO的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察計(jì)算轉(zhuǎn)染效率約80%，轉(zhuǎn)染后過(guò)表達(dá)組Smac/DIABLO蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），說(shuō)明過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO的Ishikawa細(xì)胞模型構(gòu)建成功。Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)量均明顯增加（P＜0.05），說(shuō)明Smac/DIABLO可能在線粒體介導(dǎo)通路和死亡受體介導(dǎo)通路兩條途徑發(fā)揮作用，解除IAPs對(duì)Caspase的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Smac/DIABLO與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)其通過(guò)內(nèi)源性和外源性兩條凋亡通路發(fā)揮作用，可為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后判斷及治療提供新的靶點(diǎn)。但細(xì)胞凋亡是多通路、多基因共同作用的結(jié)果，Smac/DIABLO發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確，還需對(duì)Smac/DIABLO及凋亡通路相關(guān)基因進(jìn)一步深入研究。