佩蘭乙醇提取物對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的抑制作用研究

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1.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563000；2.貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州 遵義 563000；3. 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000

結(jié)腸癌是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一，其年發(fā)病率和死亡率在逐漸升高。近年來針對腫瘤的綜合治療水平在不斷提升，但并不能有效遏制結(jié)腸癌的進(jìn)展過程，結(jié)腸癌的死亡率仍居高不下。結(jié)腸癌的防治關(guān)鍵之一在于尋求有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的藥物，探究潛在的天然產(chǎn)物作用對結(jié)腸癌的防治具有重要意義[1]。佩蘭為菊科澤蘭屬植物佩蘭EupatoriumfortuneiTurez的地上部分，又名香草、小澤蘭、大澤蘭、雞骨香，主產(chǎn)于華東、華南和西南等地區(qū)，味微苦，性寒，具有清熱解暑、芳香化濕、健胃開胃、殺蟲抑菌等功效[2]?，F(xiàn)代藥理研究證明，佩蘭提取物具有抑菌、抗炎、降脂等作用[3-5]，但其抗腫瘤活性方面的研究報道很少，其抗腫瘤機制也不明[6-7]。本研究擬通過開展佩蘭乙醇提取物體外抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖進(jìn)行初步研究，以期為后期發(fā)現(xiàn)佩蘭抗癌活性單體化合物奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱、Multiskanspectrum全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、NikonYS100熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、化學(xué)發(fā)光儀(美國伯樂公司)。

1.2 材料 佩蘭采自四川，由遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心宋長偉博士鑒定，標(biāo)本存放在醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心樣品保存室。RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(BI公司)；PBS粉末(BBI Life sciences公司)；SRB(Sigma公司)；Hoechst 33342染料(碧云天公司)；Bcl-2、Cleaved-caspase-3抗體(CST公司)。

1.3 結(jié)腸癌細(xì)胞株 人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞購于上海吉凱公司。

2 方法

2.1 乙醇回流提取法獲得佩蘭乙醇提取物 稱取100 g佩蘭粉碎成粗粉，用75%乙醇浸泡2 h，回流提取3次，合并濾液減壓蒸餾得到佩蘭提取物浸膏。

2.2 SRB法檢測佩蘭乙醇提取物對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖抑制的影響 取對數(shù)生長的細(xì)胞，以2×104個細(xì)胞/孔的濃度接種于兩塊96孔板，一塊為對照板(T0)，一塊為實驗板；CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，對照板(T0)取出進(jìn)行SRB染色，在530 nm波長下測定 OD值。染色流程如下：棄掉培養(yǎng)基，加入10% TCA固定液4℃條件下固定2 h；蒸餾水洗滌3次后自然晾干，每孔加入100 μL的4 mg/ mL的 SRB溶液，室溫下染色15 min；棄上清，1%的醋酸沖洗5次、甩干，每孔加入100 μL的10 mM Tris溶液。利用DMSO溶解佩蘭乙醇提取物后，用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度(3 μg/mL、6 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL)的藥液，且DMSO的終濃度不能超過0.5%。實驗板中加入上述配制好的不同濃度的藥液作為實驗組(T)，并設(shè)對照組(C)(加入200 μL培養(yǎng)基)，每組5個復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行 SRB染色并測量OD值，按以下公式計算腫瘤生長抑制率。

2.3 倒置顯微鏡觀察佩蘭乙醇提取物對RKO細(xì)胞形態(tài)的影響 細(xì)胞接種于兩塊96孔板(2×104個/孔)，方法同2.1。實驗分為對照組(加入200 μL培養(yǎng)基)和實驗組(佩蘭乙醇提取物組終濃度為 5 μg/ mL、7.5 μg/ mL、10 μg/ mL)。細(xì)胞加藥培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察 RKO細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.4 Western blot 檢測Bcl-2和Cleaved caspase-3的表達(dá) RKO細(xì)胞以 5×105個/孔接種于 6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，實驗分組：對照組(加入200 μL培養(yǎng)基)、佩蘭乙醇提取物組(終濃度為5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL)，培養(yǎng)48 h；提取細(xì)胞總蛋白，BCA測定蛋白樣品濃度，根據(jù)上樣量20 μg與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮沸10 min 使之變性。取樣品做 SDS-PAGE，全濕式電轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上； 封閉液封閉 1.5 h，分別加入一抗β-actin抗體、Bcl-2抗體、Cleaved caspase-3抗體，4℃孵育過夜，二抗(1∶1000)室溫孵育2 h；ECL化學(xué)發(fā)光檢測目的蛋白，在凝膠成像系統(tǒng)上測量灰度值并計算Bcl-2蛋白與Cleaved caspase-3蛋白的相對表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 佩蘭乙醇提取物對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生長抑制的影響 由圖1可知，佩蘭乙醇提取物濃度為3 μg/mL時已對RKO細(xì)胞的生長具有抑制作用；隨著佩蘭乙醇提取物濃度的增加，RKO細(xì)胞的生長抑制率增加；當(dāng)濃度為25 μg/ mL時，RKO細(xì)胞的生長完全被抑制。

3.2 佩蘭乙醇提取物對RKO細(xì)胞形態(tài)的影響 與對照組比較，佩蘭乙醇提取物終濃度為5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/m作用48 h后，實驗組RKO細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、細(xì)胞明顯皺縮變圓。如圖2所示。

3.3 佩蘭乙醇提取物對RKO凋亡過程中Bcl-2、Cleaved-caspase-3蛋白的變化 與對照組相比，當(dāng)佩蘭乙醇提取物濃度從5 μg/mL至10 μg/mL，均能使Bcl-2蛋白的相表達(dá)量降低，降低程度隨著佩蘭乙醇提取物濃度的增加而增加；同時Cleavedcaspase-3蛋白相對表達(dá)量呈濃度依賴性增加。當(dāng)佩蘭乙醇提取物濃度10 μg/mL時，Bcl-2和Cleavedcaspase-3蛋白與對照組相比有顯著差異。如圖3～4所示。

4 討論

我國2015年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌病例在全部惡性腫瘤中均位居5，其中新發(fā)病例37.6萬，死亡病例19.1萬，已成為嚴(yán)重危害中國人健康的疾病[8]?；熑耘f是臨床治療結(jié)直腸癌的主要手段之一，尋求有效抑制癌細(xì)胞生長的藥物對腫瘤的防治具有重大的意義。佩蘭始載于《本草再新》，《神農(nóng)本草經(jīng)》列佩蘭于上品；1983年國外學(xué)者在佩蘭中發(fā)現(xiàn)了相對含量較高的揮發(fā)油、倍半萜烯類、萜醇類和黃酮類物質(zhì)[6]；藥理學(xué)實驗證明佩蘭中的倍半萜內(nèi)酯及黃酮類在體外實驗中均具有抗癌活性；1993年李美麗等[7]報道了菊科佩蘭屬植物含有雙稠吡咯啶生物堿，該生物總堿在體外試驗中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。目前，對佩蘭其他抗腫瘤活性成分及其機制的研究鮮見報道；為進(jìn)一步明確佩蘭的抗腫瘤效果與機制，本研究以乙醇回流提取法獲得佩蘭乙醇提取物并作用于結(jié)腸癌RKO細(xì)胞，觀察佩蘭乙醇提取物對RKO細(xì)胞的抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示佩蘭乙醇提取物對RKO細(xì)胞的生長具有抑制作用，抑制效果隨著濃度增加而升高；倒置顯微鏡觀察顯示佩蘭乙醇提取物作用于RKO細(xì)胞后，細(xì)胞核發(fā)生皺縮或裂解等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；與細(xì)胞凋亡相關(guān)的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)呈劑量依賴性降低，而活化形式的促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達(dá)則呈劑量依賴性降低。以上結(jié)果提示佩蘭乙醇提取物呈濃度依賴性地促進(jìn)RKO細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡受多條信號通路調(diào)控，眾多關(guān)鍵蛋白在凋亡中發(fā)揮重要作用；其中Bcl-2基因被稱為“存活基因”，其基因產(chǎn)物Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞丟失、阻止細(xì)胞凋亡的作用[10]；Bcl-2基因激活與大腸癌分化、轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為大腸癌預(yù)后的指標(biāo)之一[11]。激活的Caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，具有剪切管家蛋白和DNA片段的功能，是參與凋亡途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子。本研究發(fā)現(xiàn)佩蘭乙醇提取物可以使RKO細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而活化的Caspase-3蛋白表達(dá)增加；佩蘭乙醇提取物可能通過抑制了Bcl-2蛋白的表達(dá)、促進(jìn)活化的Caspase-3蛋白的表達(dá)而達(dá)到促細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，佩蘭乙醇提取物可以抑制RKO細(xì)胞生長，通過抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)和促進(jìn)caspase-3蛋白的活化而促使RKO細(xì)胞發(fā)生凋亡；具體何種成分發(fā)揮了該功效需要進(jìn)一步通過天然藥物化學(xué)的分離技術(shù)輔以活性追蹤的手段捕捉活性單體化合物。