黃芪甲苷抑制上皮細胞凋亡的研究進展

王亞芳，成海建，張清峰，姜富貴，譚秀文，劉倚帆，宋恩亮*

(1.山東師范大學(xué)生物學(xué)院，山東濟南 250000；2.山東省家畜繁育與疫病防控重點實驗室，山東濟南 250100；3.山東省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心,山東濟南 250100；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南 250100)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[1]，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等中醫(yī)功效[2-3]。黃芪中包括皂苷類、黃酮類和多糖類等多種化學(xué)成分，而黃芪甲苷是現(xiàn)在研究較多的活性成分之一。黃芪甲苷屬于四環(huán)三萜類皂苷，分子式為C41H68O14，相對分子質(zhì)量為784.97，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 1[4]。黃芪甲苷具有抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種生物功能[5-6]。近年來，黃芪甲苷對細胞凋亡的抑制作用成為研究熱點，包括對上皮細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞等凋亡的抑制作用及機制。

上皮細胞是位于皮膚或腔道表層的細胞，在人或者動物體內(nèi)廣泛存在，其中被覆上皮分布在表皮、內(nèi)皮、間皮及呼吸、消化與泌尿生殖道粘膜上皮；腺上皮分布于外分泌和內(nèi)分泌腺細胞；感覺上皮分布于聽、視、平衡、嗅與味覺上皮；特化上皮分布于肌上皮細胞及胸腺上皮性網(wǎng)狀細胞等。皮膚外層的上皮細胞通常發(fā)生角質(zhì)化，發(fā)揮吸收和保護的作用。腔道中的上皮細胞可分化成多種形式，具有分泌、吸收和排泄等功能[7]。總之，上皮細胞在機體內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境中具有十分重要的意義。因此，本文主要就黃芪甲苷對上皮細胞凋亡的抑制作用進行綜述。

圖1 黃芪甲苷結(jié)構(gòu)圖

1 細胞凋亡途徑與調(diào)控

細胞凋亡作為細胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是細胞程序性死亡中特有的一種細胞死亡方式，是細胞在一系列內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的自然或生理性死亡過程，能去除不需要的或異常的細胞[8]。1972年Kerr等就提出了凋亡和死亡的概念。凋亡發(fā)生在單個細胞之間，特征是細胞萎縮、染色質(zhì)凝聚、細胞聚集成團、形成凋亡小體等特征，凋亡小體可被巨噬細胞吞噬，不會引發(fā)周圍細胞的炎癥反應(yīng)；壞死一般發(fā)生在多個細胞之間，一般表現(xiàn)為細胞膜破裂、細胞腫脹破裂，細胞核被溶解等，同時引發(fā)炎癥反應(yīng)，因此壞死和凋亡之間具有本質(zhì)性區(qū)別[9-10]。

凋亡發(fā)生的途徑主要有三種：(一)線粒體途徑，又稱為內(nèi)源性途徑，該途徑分為兩類，一類需要先激活Caspase 通路促進凋亡，誘導(dǎo)線粒體中的細胞色素C(CytC)釋放到細胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶活化因子1 (Apoptosis protease activating factor 1，APAF-1) 結(jié)合形成多聚體，構(gòu)成的多聚體再結(jié)合凋亡起始分子Caspase-9 形成凋亡小體，Caspase-9凋亡小體激活，從而使凋亡執(zhí)行分子Caspase-3，Caspase-6 和Caspase-7 等誘導(dǎo)細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)；另一類是經(jīng)由線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis induce factor，AIF)直接誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生；(二)死亡受體途徑，又稱為外源性途徑，死亡受體與FADD結(jié)合后激活了Caspase-8 、caspase-10，進一步激活凋亡執(zhí)行者Caspase-3，Caspase-6 和Caspase-7，促進凋亡的發(fā)生；(三)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使得細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡或鈣離子過多，一方面激活caspase-12，從而caspase-9被激活而促進凋亡，另一方面誘導(dǎo)B 細胞淋巴瘤蛋白 (Bcl-2)家族中促凋亡蛋白 Bax 和Bak的激活誘導(dǎo)凋亡[11-12]。

細胞凋亡的發(fā)生受多種基因的共同調(diào)控，其中抑制凋亡基因有Bcl-2、ced-9、Bcl-xL、Mcl-1等；促進凋亡基因有Bax、Nbk、Bak、Bad等；雙向調(diào)控基因有：c-myc。當Bcl-2與其他基因如 C-myc、p53等相互作用可抑制細胞的增殖及程序性死亡，抑癌基因p53 參與啟動DNA受到損害的細胞的凋亡，而C-myc表達的下調(diào)可促進凋亡，但在某些情況下，當關(guān)鍵性生長因子缺乏時，C-myc的高表達也可促使細胞凋亡[13]。

2 黃芪甲苷對上皮細胞的保護作用

細胞的凋亡和壞死在生物體中起著重要的作用[14]，許多疾病的發(fā)生都和細胞凋亡的紊亂有著直接或是間接的關(guān)系，如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病毒感染等[15]。經(jīng)查閱相關(guān)文獻得出結(jié)論，黃芪甲苷可抑制上皮細胞的凋亡從而對機體發(fā)揮保護作用。

2.1 黃芪甲苷對腎小管上皮細胞的保護作用

目前，無論是在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率逐漸上升[16]。慢性腎臟病人在不同的發(fā)病階段的具體病癥各不相同，發(fā)病初期僅有腰酸無力等輕微癥狀。而在后期，會出現(xiàn)高血壓、消化道紊亂等癥狀，嚴重時危及生命。因此治療過程中會消耗大量的人力、財力及衛(wèi)生資源，給我國醫(yī)療行業(yè)帶來嚴峻挑戰(zhàn)。腎纖維化大多是慢性腎臟病中細胞外基質(zhì)過度積累所導(dǎo)致的，而腎纖維化發(fā)生的主要原因之一就是腎小管上皮細胞的凋亡[17]。

田磊等[18]探討黃芪甲苷(AS-IV) 抑制TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡的機制，將實驗小鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和治療組，連續(xù)7天灌胃給藥，術(shù)后第14天采集腎臟組織，經(jīng)過檢驗得出結(jié)論：AS-IV可改善單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎組織內(nèi)TGF-β1 表達 (P<0. 01)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的 HK-2 細胞活性下降，進而抑制細胞凋亡，且200 μg/ml AS-IV 作用最明顯(P<0. 01) 。

腎臟病的病因有很多，一方面是由免疫傷害所引起，另一方面是由糖尿病、高血壓等疾病所引起。而腎小球細胞凋亡與該病之間具有一定的相關(guān)性[19]。Wang[20]等針對AS-IV對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞凋亡的抑制作用進行了研究, 通過體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞,分為低糖組和高糖組并分別在高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的AS-IV，在處理后 0、1、12、24、48、96 h觀察，檢測各組細胞凋亡情況。經(jīng)過研究得出結(jié)論：高糖環(huán)境能誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞凋亡，黃芪甲苷可有效地抑制其凋亡，其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性與時間依賴性。

急性腎損傷是由多種病因所引起的腎功能下降而引發(fā)的一種常見疾病，腎小管上皮細胞的損傷以及缺血等都能造成這種疾病，特點是細胞的凋亡[21]，可通過干細胞移植治療，但是干細胞的移植存活又是一大難題，王葳[22]等通過觀察黃芪甲苷孵育后的脂肪源性干細胞對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的作用，將實驗分為四組，分別為順鉑損傷組、脂肪源性干細胞+損傷腎小管上皮細胞組、黃芪甲苷孵育脂肪源性干細胞+損傷腎小管上皮細胞組、正常對照組。結(jié)果顯示，與正常組相比，順鉑損傷組的細胞凋亡的最多，加入脂肪源干細胞共培養(yǎng)后細胞凋亡減少，而加入黃芪甲苷培養(yǎng)后細胞凋亡數(shù)量明顯減少。因此實驗對比得出結(jié)果，黃芪甲苷孵育的人脂肪源性干細胞對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡具有抑制作用，從而有利于腎小管損傷的早期恢復(fù)。

2.2 黃芪甲苷對視網(wǎng)膜上皮細胞的保護作用

目前已知糖尿病能引發(fā)多種并發(fā)癥，不但能導(dǎo)致腎病，還能致使視網(wǎng)膜病變。糖尿病視網(wǎng)膜病變主要和體內(nèi)自由基所介導(dǎo)的氧化損傷相關(guān)聯(lián)，并致使細胞凋亡。甲基乙二醛的積累可導(dǎo)致多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，因此認為是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵物質(zhì)[23]。周云豐等人[24]研究黃芪甲苷( AS-IV) 對甲基乙二醛( MGO) 誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)損傷的作用。首先培養(yǎng)ARPE-19 細胞，然后再找出MGO和AS-IV的最佳作用濃度，通過多種檢測發(fā)現(xiàn)，ARPE-19 細胞的活力與MGO的劑量成反比，AS-IV能逆轉(zhuǎn)MGO引起的細胞活力下降，從而抑制細胞凋亡。

2.3 黃芪甲苷對肺泡上皮細胞的保護作用

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見的一具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和肺氣腫，吸煙引起的肺氣腫是一種自身免疫性疾病[30]，一些研究發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)細胞的凋亡是引發(fā)該病的關(guān)鍵[25]。楚琪等[26]人通過觀察黃芪甲苷對慢性阻塞性肺疾病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞凋亡的保護作用。將大鼠隨機分為對照組、模型組和黃芪甲苷低、中、高劑量組，連續(xù)14天采用腹腔注射法對大鼠注藥。結(jié)果顯示，黃芪甲苷可改善肺組織細胞凋亡，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 黃芪甲苷對胃黏膜上皮細胞的保護作用

胃內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，但大多數(shù)情況下仍能處于正常的生理狀態(tài)，主要是因為胃內(nèi)存在胃黏膜屏障。胃粘膜屏障是由胃黏膜上皮細胞頂部的細胞壁和連接鄰近細胞的緊密連接構(gòu)成的一個脂蛋白層。胃黏膜屏障除具有多種作用，如機械保護作用、阻止胃蛋白酶通過、保護粘膜免受損傷以及其他因素侵蝕損傷的作用。因此，胃粘膜上皮細胞的完整性和分泌功能的正常，對機體內(nèi)胃粘膜的保護至關(guān)重要。孫雪蓮[27]等就探討了黃芪皂苷及黃芪甲苷對胃損傷大鼠的胃粘膜上皮細胞的影響，將大鼠隨機分為正常組，模型組，AST高、低劑量預(yù)防組，AS-IV高、低劑量預(yù)防組，模型自然恢復(fù)組，AST高、低劑量治療組，AS-IV高、低劑量治療組。實驗結(jié)果顯示：慢性胃粘膜損傷大鼠的胃粘膜屏障受到破壞，AST及AS-IV均具有保護胃粘膜屏障的作用。AST的作用明顯優(yōu)于AS-IV，且隨劑量的增加，AST的優(yōu)越性更加明顯，大劑量的作用接近正常組的水平。AST在較低劑量的情況下可以達到甚至超過AS-IV大劑量的作用效應(yīng)。

3 結(jié)語

綜上所述，黃芪甲苷可通過降低caspase-3的表達、阻斷p38 MAPK信號通路、抑制JNK磷酸化等途徑，對多種上皮細胞的凋亡均具有一定的抑制作用。目前犢牛早期上皮的完整性對犢牛的消化吸收和免疫屏障的建立對犢牛的成活率和生長發(fā)育狀態(tài)至關(guān)重要。外來病原微生物或異物在腸道內(nèi)產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)可以對小腸上皮造成損傷引起上皮的壞死或凋亡后壞死。黃芪甲苷對腸上皮細胞的凋亡是否也具有抑制作用，有待于進一步的研究。