重組人甲狀旁腺激素1-34對豚鼠骨關節(jié)炎的改善作用

王羅春 洪敏

摘 要 目的：評估重組人甲狀旁腺激素1-34（PTH1-34）對豚鼠自發(fā)性骨關節(jié)炎的作用。方法：采用6月或10月齡豚鼠，每天皮下注射生理鹽水或PTH1-34或復泰奧3個月，考察II型膠原C端肽CTX-2、骨鈣素OC、組織病理學OARSI評分、骨體積分數(shù)BV/TV及骨小梁模式因子Tb.pf等指標。結(jié)果：6月齡豚鼠給藥后，PTH1-34或復泰奧可降低CTX-2水平、OARSI評分、Tb.pf，提高BV/TV，對豚鼠骨關節(jié)炎有改善作用；PTH1-34 30及60 mg/kg改善明顯，停藥1個月后30 mg/kg組仍可見明顯骨改善。10月齡豚鼠PTH1-34給藥后雌性動物Tb.pf明顯低于對照，認為存在骨改善。結(jié)論：PTH1-34對6月齡豚鼠骨關節(jié)炎有明顯改善作用，對10月齡豚鼠也有一定程度骨質(zhì)量改善。

關鍵詞 骨關節(jié)炎 重組人甲狀旁腺激素1-34 復泰奧

中圖分類號：R977.14； R965 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）15-0103-05

Effects of recombinant human parathyroid hormone 1-34 on osteoarthritis in guinea pigs*

WANG Luochun1**， HONG Min2

（1. Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research / Shanghai InnoStar Bio-Tech Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the effects of recombinant human parathyroid hormone 1-34 （PTH1-34） on spontaneous osteoarthritis in guinea pigs. Methods： Six or ten months-old guinea pigs were subcutaneously injected daily with saline， PTH1-34 or Forsteo for 3 months. The changes of C-telopeptides of type II collagen （CTX-2）， osteocalcin （OC）， histopathological OARSI score， bone volume fraction BV/TV， and bone trabecular pattern factor Tb.pf were observed. Results： CTX-2 levels， OARSI score and Tb.pf were decreased while BV/TV was increased in 6-month-old guinea pigs after administration of PTH1-34 or Forsteo compared with saline control， which indicated that PTH1-34 or Forsteo could improve guinea pig osteoarthritis and furthermore， the improvement was more significant in guinea pigs with PTH1-34 dosage 30 or 60 mg/kg. Bone improvement was still visible in guinea pigs with PTH1-34 30 mg/kg after 1 month recovery. The Tb.pf level in female 10 months-old guinea pigs was significantly lower than that of the control after PTH1-34 was administered， which was considered that there existed bone improvement. Conclusion： PTH1-34 has a significant improvement effect on spontaneous osteoarthritis in 6 months old guinea pigs， while only a certain degree of improvement in 10 months old guinea pigs.

KEy WORDS osteoarthritis； recombinant human parathyroid hormone 1-34； Forsteo

骨關節(jié)炎（osteoarthritis， OA）是由多種因素引起關節(jié)軟骨病變而導致以關節(jié)疼痛為主要癥狀的退行性疾病，嚴重影響生活質(zhì)量。OA發(fā)生與年齡相關，中老年人發(fā)病率高，65歲以上人群50%以上為OA患者。目前OA藥物治療如鎮(zhèn)痛藥物、關節(jié)腔注射藥物等，仍然是以緩解疼痛、延緩疾病進展為主，無法有效治療或改善骨關節(jié)炎疾病進程[1，2]。

以重組人甲狀旁腺激素1-34（recombinant human parathyroid hormone 1-34， rhPTH1-34）為活性成分的上市產(chǎn)品復泰奧（FORSTEO， teriparatide）是美國禮來公司研發(fā)，用于治療骨質(zhì)疏松的生物藥物[3，4]。研究表明，復泰奧對模型大鼠、小鼠、猴、或兔的骨損傷或關節(jié)軟骨損傷修復都具有較好的作用，目前復泰奧正被用于一項治療OA的Ⅱ期臨床探索性研究[5-9]。豚鼠2月齡膝關節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常，3月齡開始病變，4～6月齡骨關節(jié)炎逐步加重，9月齡關節(jié)軟骨逐步降解，因此豚鼠隨月齡自然發(fā)生的骨關節(jié)炎是與人骨關節(jié)炎病變機制最為接近的動物模型[10-13]。本研究考察重組人甲狀旁腺激素1-34注射液（PTH1-34）對豚鼠骨關節(jié)炎的改善情況，以便為本品新藥開發(fā)臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥物

重組人甲狀旁腺激素1-34（簡稱PTH1-34）（上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司研制，無色澄清液體，批號20140501、20141001、20141101）；復泰奧（Eli Lilly and Company市售，無色澄清液體，批號C104325E、C174138D）。每日給藥前將供試藥物用滅菌生理鹽水稀釋至適當濃度，置2～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

豚鼠為Hartley-Dunkin品系，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號11400700049877（雌性）、11400700050386（雄性）；豚鼠骨關節(jié)炎隨月齡自然發(fā)生。

1.3 關鍵實驗器材

SkyScan1076型Micro CT（比利時Skyscan 公司）。

1.4 動物分組與給藥劑量

實驗動物分組及給藥情況詳見表1；實驗共分8組，采用不對稱設計。第1～5組為6月齡豚鼠，以隨機分組方式減少組間差異，分別皮下注射生理鹽水或PTH1-34 15、30或60 mg/kg或復泰奧30 mg/kg，每天一次，給藥3個月后考察；生理鹽水和PTH1-34 30 mg/kg組恢復1個月后再次考察。第6～8組為10月齡豚鼠，隨機分組，分別皮下注射生理鹽水或PTH1-34 15或30 mg/kg，每天一次，給藥3個月后考察。

1.5 考察指標及方法

1）Ⅱ型膠原C端肽（CTX-2） 豚鼠給藥后各組各期隨機采集5～6只動物全血各約1 ml，分離血清，用 Mybiosource公司ELISA 試劑盒檢測[14]。

2）骨鈣素（osteocalcin，OC） 豚鼠給藥后各組各期隨機采集5～6只動物全血各約1 ml，分離血清，用Mybiosource公司ELISA試劑盒檢測[15]。

3）組織病理學評分（OARSI評分） 豚鼠給藥后各組各期隨機采集4～5只動物膝關節(jié)標本進行關節(jié)軟組織連續(xù)切片，再用Safranin O Fast Green染色來評估OARSI評分[16]。

4）骨體積分數(shù)（BV/TV）和骨小梁模式因子（Tb. pf） 豚鼠給藥后各組各期隨機采集5～6只動物膝關節(jié)標本進行Micro CT掃描，獲得BV/TV和Tb.pf參數(shù)結(jié)果[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTX-2檢測

CTX-2反映軟骨損傷，6月齡豚鼠給藥各組各期隨時間進展CTX-2逐漸升高；10月齡豚鼠由于骨關節(jié)炎進展嚴重（與2.3、2.4結(jié)果相印證）未見CTX-2與時間的相關性。總體上，該指標結(jié)果反映了與月齡相關的骨關節(jié)炎進程（表2、表3）。

6月齡豚鼠連續(xù)給予PTH1-34或復泰奧3個月后，雌性動物CTX-2水平呈降低趨勢，停藥1個月后仍可見藥效作用；雄性動物未見明顯改變。10月齡豚鼠由于動物骨關節(jié)炎進展嚴重，檢測數(shù)據(jù)變異度較大，各組間未見統(tǒng)計學顯著性差異。

2.2 OC檢測

OC水平變化反映成骨細胞的活性和骨轉(zhuǎn)換的程度，總體上OC水平在豚鼠骨關節(jié)炎中變化不明顯。但是，部分豚鼠（如6月齡雄性豚鼠PTH1-34 15 mg/kg組、復泰奧30 mg/kg組，及10月齡雄性豚鼠PTH1-34 15 mg/kg組）給藥3個月后，OC水平比同期生理鹽水組都有所提高，提示有改善作用。（表4、表5）。

2.3 組織病理學OARSI評分

OARSI評分（等于Grade×Stage）反映關節(jié)軟骨損傷的程度，6月齡豚鼠生理鹽水組Grade、Stage、及OARSI評分值均隨著時間推移而升高，反映了6月齡豚鼠給藥3個月及恢復1個月的骨關節(jié)炎進程（表6～表8）。

6月齡豚鼠PTH1-34 30 mg/kg組給藥2個月后， OARSI分值出現(xiàn)改善趨勢，雌性動物改善50%～80%，雄性動物則改善較??；給藥3個月，PTH1-34各劑量組及復泰奧組雌雄動物均出現(xiàn)改善趨勢，其中PTH1-34 15 mg/kg組改善10%～30%，其它給藥組改善50%～85%?；謴推?個月時，可能由于豚鼠骨關節(jié)炎進展嚴重，組間變化程度相當。

10月齡豚鼠由于骨關節(jié)炎進展程度嚴重，鏡下難以判斷OARSI分值差異（表9）?？傊?，6月齡豚鼠連續(xù)給予PTH1-34或復泰奧2～3個月，對豚鼠骨關節(jié)炎軟骨損傷的進展有一定的改善作用。

2.4 BV/TV和Tb.pf的參數(shù)

BV/TV反映骨形成的代謝狀況，Tb.pf反映成骨質(zhì)量（Tb.pf數(shù)值與骨質(zhì)量成反比），6月齡豚鼠生理鹽水組雌性和雄性動物的TV/BV和Tb.pf各期間無明顯變化，反映對照組動物在骨關節(jié)炎發(fā)展過程中骨形成和骨質(zhì)量均維持在同一水平（表10、表11）。

6月齡豚鼠PTH1-34或復泰奧給藥后各組各期，BV/TV均明顯升高，Tb.pf均明顯低于同期生理鹽水組，即骨質(zhì)量明顯提高?；謴推?個月仍可見藥效學作用。 10月齡豚鼠PTH1-34給藥3個月均可見BV/TV有升高和Tb.pf有下降的趨勢；但是由于動物變異度較大，僅雌性動物Tb.pf存在統(tǒng)計學顯著性差異（表12）。

3 討論

6月齡豚鼠PTH1-34 30 mg/kg給藥2個月后CTX-2水平均高于生理鹽水組，機制尚不清楚。

10月齡豚鼠給藥后，出現(xiàn)多組給藥1個月CTX-2數(shù)據(jù)高于本組給藥3個月的結(jié)果，組內(nèi)差異度大于均值，組間數(shù)據(jù)變化較大、沒有規(guī)律（表3）。分析認為，這主要是由于在豚鼠骨關節(jié)炎發(fā)生與進展過程中關節(jié)軟骨先是經(jīng)歷細胞肥大、增殖、和降解的過程，此時CTX-2隨病情進展而升高（6～9月齡）；隨著病情加重，關節(jié)軟骨逐步消融，此時CTX-2達到高峰后迅速降低（10～12月齡）[16]，因此會出現(xiàn)表中3個月結(jié)果低于1個月結(jié)果的情形。同時由于到后期各動物個體病情進展差異較大，導致組內(nèi)差異度大于均值、組間數(shù)據(jù)變化沒有規(guī)律。

另外，本研究中各項考察指標各組各期的檢測結(jié)果差異度都比較大，這是由于各組內(nèi)動物個體骨關節(jié)炎進展差異所造成的。后續(xù)研究可以在動物隨機分組前，通過限定入組豚鼠的體重范圍、增加入組前早期骨關節(jié)炎生物標志物（如CTX2）檢測等措施來縮小個體差異，從而保障研究數(shù)據(jù)的均一性。

總體而言，除骨鈣素OC指標不敏感外，CTX-2、OARSI評分、BV/TV、及Tb.pf均能較好地反映豚鼠自發(fā)性骨關節(jié)炎的進展，顯示PTH1-34或復泰奧對豚鼠骨關節(jié)炎的治療或改善作用。6月齡豚鼠給藥后，CTX-2水平、OARSI評分（包括Grade和Stage）、BV/TV及 Tb.pf均顯示PTH1-34或復泰奧對豚鼠明顯的骨改善，其中15 mg/kg改善較少，30及60 mg/kg改善明顯，停藥1個月后PTH1-34 30 mg/kg組仍可見明顯的改善作用。10月齡豚鼠由于病程進展嚴重，給藥后CTX-2、ORASI評分均不能區(qū)分骨關節(jié)炎的改善情況；但是在MicroCT檢查中，PTH1-34 15及30 mg/kg組雌性動物的Tb.pf明顯低于對照組，認為存在骨改善。本試驗條件下，PTH1-34對6月齡豚鼠骨關節(jié)炎有明顯改善作用，對10月齡豚鼠也有一定程度的骨質(zhì)量改善。

參考文獻

[1] 王坤正， 曹力， 陳繼營， 等. 骨關節(jié)炎診療指南（2018年版）[J]. 中華骨科雜志， 2018， 38（12）： 705-715.

[2] Hauser RA. The acceleration of articular cartilage degeneration in osteoarthritis by nonsteroidal antiinflammatory drugs[J]. J Prolother， 2010， 2（1）： 305-322.

[3] Eli Lilly and Company. FORTEO-teriparatide injection， solution[EB/OL]. [2019-02-21]. http：//uspl.lilly.com/forteo/ forteo.html#pi.

[4] Lilly France S. A. S. 特立帕肽注射液[EB/OL]. [2019-02-21]. http：//drugs.medlive.cn/drugref/html/18797.shtml.

[5] Sato M， Zeng GQ， Turner CH. Biosynthetic human parathyroid hormone （1–34） effects on bone quality in aged ovariectomized rats[J]. Endocrinology， 1997， 138（10）： 4330-4337.

[6] Sampson ER， Hilton MJ， Tian Y， et al. Teriparatide， a chondroregenerative therapy for injury-induced osteoarthritis[J/ OL]. Sci Transl Med， 2011， 3（101）： 101ra93. doi： 10.1126/ scitranslmed.3002214.

[7] Bellido M， Lugo L， Roman-Blas JA， et al. Improving subchondral bone integrity reduces progression of cartilage damage in experimental osteoarthritis preceded by osteoporosis[J]. Osteoarthritis Cartilage， 2011， 19（10）： 1228-1236.

[8] Orth P， Cucchiarini M， Zurakowski D， et al. Parathyroid hormone [1-34] improves articular cartilage surface architecture and integration and subchondral bone reconstitution in osteochondral defects in vivo[J]. Osteoarthritis Cartilage， 2013， 21（4）： 614-624.

[9] U. S. National Library of Medicine. Teriparatide as a chondroregenerative therapy in OA [EB/OL]. [2019-02-10]. https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03072147.

[10] Bendele AM， White SL， Hulman JF. Osteoarthrosis in guinea pigs： histopathologic and scanning electron microscopic features[J]. Lab Anim Sci， 1989， 89（2）： 115-121.

[11] Gurkan I， Ranganathan A， Yang X， et al. Modification of osteoarthritis in the guinea pig with pulsed low-intensity ultrasound treatment[J]. Osteoarthritis Cartilage， 2010， 18（5）： 724-733.

[12] Muraoka T， Hagino H， Okano T， et al. Role of subchondral bone in osteoarthritis development[J]. Arthritis Rheum， 2007， 56（10）： 3366-3374.

[13] 藥審中心組織翻譯. 骨關節(jié)炎治療藥物臨床研究指導原則[EB/OL]. [2019-02-22]. http：//www.cde.org.cn/guide. do？method=showGuide&id=277.

[14] Huebner JL， Kraus VB. Assessment of the utility of biomarkers of osteoarthritis in the guinea pig[J]. Osteoarthritis Cartilage， 2006， 14（9）： 923-930.

[15] Singh S， Kumar D， Kumar Lal A. Serum osteocalcin as a diagnostic biomarker for primary osteoporosis in women[J/ OL]. J Clin Diagn Res， 2015， 9（8）： RC4-RC7. doi： 10.7860/ JCDR/2015/14857.6318.

[16] Pritzker KPH， Gay S， Jimenez SA， et al. Osteoarthritis cartilage histopathology： grading and staging[J]. Osteoarthritis Cartilage， 2006， 14（1）： 13-29.

[17] Chappard C， Peyrin F， Bonnassie A， et al. Subchondral bone micro-architectural alterations in osteoarthritis： a synchrotron micro-computed tomography study[J]. Osteoarthritis Cartilage， 2006， 14（3）： 215-223.