轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)研究進展

謝德明 陳良 龍小曾

摘要 本文綜述了轉(zhuǎn)基因雞的研究及應(yīng)用，并介紹了3種常用的制備方法，包括外源基因受精卵注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因、利用慢病毒載體實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的介入和導(dǎo)向，以期為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因雞；研究；應(yīng)用；制備方法

中圖分類號 S831 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）12-0229-02

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究雖然備受爭議，但是由于其具有廣闊的應(yīng)用前景，近年來發(fā)展迅速。與哺乳動物相比，禽類具有特殊的生殖系統(tǒng)，因而家禽的轉(zhuǎn)基因研究相對滯后。影響轉(zhuǎn)基因家禽研制的關(guān)鍵因素在于表達(dá)載體的選擇和外源基因的導(dǎo)入方式，這決定了轉(zhuǎn)基因家禽的孵化率和轉(zhuǎn)染率。本文對轉(zhuǎn)基因雞的制備技術(shù)作一綜述，對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的合理應(yīng)用具有重要意義。

1 轉(zhuǎn)基因雞的研究及應(yīng)用

1.1 輸卵管反應(yīng)器的研究

利用動物體所具有的生物功能，在其體內(nèi)經(jīng)過生物自身的代謝，能夠獲得目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞、組織器官的方法稱之為動物生物反應(yīng)器法[1-2]。生物反應(yīng)器類型主要根據(jù)蛋白表達(dá)部位不同來劃分，主要有血液、膀胱、唾液腺、乳腺、輸卵管等生物反應(yīng)器[3]。乳腺和輸卵管兩大生物反應(yīng)器的廣泛應(yīng)用受到了研究者們的高度關(guān)注。

干擾素、單克隆抗體等藥用蛋白能夠用于治療人類疾病，通過生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)的成本昂貴且耗時，加上產(chǎn)量又不高，無法滿足臨床醫(yī)學(xué)的需求[4]。起初人們認(rèn)為乳腺最有希望成為產(chǎn)生某些藥用蛋白的生物反應(yīng)器[5]，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺作為生物反應(yīng)器也具有一定的缺陷，如哺乳動物世代間隔時間長，其中的乳蛋白和脂肪生化成分難以證實，重組蛋白的分離提純耗費大且難度較大。而禽類大部分蛋白的糖基化與人類的較為接近，能避免乳腺中出現(xiàn)的許多問題[6]。由此，人類開啟了對轉(zhuǎn)基因禽類輸卵管反應(yīng)器的研究，希望能獲得生產(chǎn)人類藥用蛋白的新途徑。

1.2 轉(zhuǎn)基因雞的應(yīng)用

1.2.1 改良雞的種質(zhì)品質(zhì)，提高產(chǎn)品質(zhì)量。雞肉營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，維生素含量豐富，雞肉脂肪中含大量不飽和脂肪酸，易于消化吸收，是人類日常肉類食物的重要組成部分。雞作為經(jīng)濟養(yǎng)殖動物在畜牧業(yè)中也最為常見，具有巨大的商業(yè)價值。轉(zhuǎn)基因雞能夠改良雞的種質(zhì)品質(zhì)，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

1.2.2 生產(chǎn)藥用蛋白。轉(zhuǎn)基因雞作為生物反應(yīng)器，主流的應(yīng)用方向是生產(chǎn)藥用蛋白。在利用哺乳動物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器表達(dá)部分人用藥物蛋白時，常出現(xiàn)宿主細(xì)胞死亡率較高的現(xiàn)象，但如果選擇雞細(xì)胞作為宿主來表達(dá)，則對其正常的機體功能無任何損傷。與他家畜相比，雞具有養(yǎng)殖成本較低、繁殖周期短、便于規(guī)模管理等特點，雞的產(chǎn)蛋數(shù)量多、蛋白含量高，雞蛋內(nèi)部有天然無菌環(huán)境，蛋白分離提純簡單。對生物制藥業(yè)來說，雞輸卵管生物反應(yīng)器可以作為臨床醫(yī)學(xué)藥用蛋白高效生產(chǎn)的理想途徑。在轉(zhuǎn)基因雞的研究中，Kwon等[7]制備了促紅細(xì)胞生成素，Daisuke等[8]制備了粒細(xì)胞集落刺激因子，Kyogoku等[9]制備了化腫瘤壞死因子的Fc受體融合蛋白等藥物蛋白。

1.2.3 抗病育種。經(jīng)過不斷發(fā)展，在分子生物學(xué)、遺傳生物學(xué)等領(lǐng)域和繁殖育種方面，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用越發(fā)成熟和普遍，這皆因轉(zhuǎn)基因雞能改善雞的遺傳性狀。轉(zhuǎn)基因雞不僅可以改善雞的機體性能，還可以提高新品種雞的培育速度，提高飼料轉(zhuǎn)化率，增加蛋雞產(chǎn)蛋量，提升肉雞質(zhì)量，改變脂肪/肌肉比例等[10]。轉(zhuǎn)基因雞的成功制備能在一定程度上提高雞對疾病的抵抗力。危害嚴(yán)重的雞傳染性疾病不僅給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟損失，而且還會對人類的身體健康造成重大威脅?，F(xiàn)如今，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的抗病物種具有諸多優(yōu)點。一是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用將一些其他物種的抗性基因?qū)腚u的基因組中，不僅能打破物種隔閡，還可以定向誘導(dǎo)培育，大幅縮減繁殖育種時間；二是避免自然交配育種耗時長、篩選單一、獲得目的性狀的概率小等缺點；三是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用可避免在家禽疾病預(yù)防中疫苗的長期使用和濫用，以及給食物帶來安全隱患等缺點。轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)已是科學(xué)研究中常用的手段，為解決動物疾病問題開辟了新途徑。例如，在2011年國外某研究所首次研發(fā)出對禽流感有一定抵抗力的轉(zhuǎn)基因雞[11]。

1.2.4 用作模型動物。在發(fā)育生物學(xué)模式動物中轉(zhuǎn)基因雞可充當(dāng)重要角色，這是因為其來源廣泛，取材容易，且可擁有很多常見的、已經(jīng)被科學(xué)家成功定位的功能基因。如雞的絲羽[12]、黃皮膚[13]以及雞的巧瑰冠[14]等，通過基因敲除和基因表達(dá)等分子生物學(xué)技術(shù)以及試驗進行驗證，可將其用作研究鳥綱動物的模型動物。

1.3 轉(zhuǎn)基因雞研究中出現(xiàn)的問題

1.3.1 轉(zhuǎn)基因雞制作的方法問題。目前，利用實驗動物進行轉(zhuǎn)基因研究的效率普遍較低，而利用家畜的效率尤其低。加上在轉(zhuǎn)基因禽類制作技術(shù)中，除了利用慢病毒法以外，其余的方法都不夠完善。轉(zhuǎn)基因雞制備成功的報道較少，其中有些報道僅限于在胚胎中未能出雛，還有的是嵌合體雞。應(yīng)用前景較好的有慢病毒法、PGCs制作法，但其在操作技術(shù)上還有很大的改善空間。

1.3.2 在宿主染色體中轉(zhuǎn)基因整合的行為問題。目前的外源基因容易導(dǎo)致內(nèi)源性基因破壞、失活或激活處于關(guān)閉狀態(tài)，因為在所有的轉(zhuǎn)基因動物中插入宿主的染色體均是隨機的，還有可能導(dǎo)致插入位點臨近的染色體發(fā)生重排、缺失、重復(fù)或易位，其結(jié)果往往會導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性個體、出雛后不育、胚胎死亡和四肢畸形等異常現(xiàn)象。

2 轉(zhuǎn)基因雞制備常用方法

2.1 外源基因受精卵注射

外源基因受精卵注射，即通過口吸管連接毛細(xì)玻璃針，在體式顯微鏡下向宿主動物受精卵中直接注入外源基因，外源基因通過受精卵分裂過程中的修復(fù)機制整合到宿主細(xì)胞基因組中，使其繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物[15]。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物常用的方法，其一便是外源基因新受精卵原核注射。

通過試驗證明了利用受精卵顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家禽是可行的，但雞具有特殊的生殖結(jié)構(gòu)和生理特點，當(dāng)新鮮雞蛋剛排出時雞胚已經(jīng)發(fā)育，因而難以找到受精的原核，因為其一個卵子同時允許多個精子進入，而雞受精卵的顯微注射實際是胞質(zhì)注射，主要過程是將外源基因注射到胞質(zhì)中，由于成本較高，一般實驗室不具備相關(guān)專業(yè)設(shè)備，同時對該技術(shù)的操作要求較高，導(dǎo)致這種方法的運用難以推廣。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法的主要過程：將外源基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上；轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)毒，收集后經(jīng)超離心得到高濃度的病毒顆粒；將病毒液通過顯微注射注入雞的受精卵或胚盤中；通過病毒的作用，把外源基因整合到受精卵或胚盤干細(xì)胞基因組中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒具有強大的侵染能力，故能將外源基因融合導(dǎo)入宿主細(xì)胞染色體中，并能避免僅在特定部位注射，從而使該方法成為外源基因轉(zhuǎn)移的理想途徑[16]。

1986年，Salter等[17]以發(fā)育雞胚的胚盤為注射部位，顯微注入網(wǎng)織內(nèi)皮增生病病毒（reticuloendotheliosis virus，RE-V），同時注入雞重組白血病病毒（recombinat avian leucosis virus，re-ALV），得到的個體性成熟后繼續(xù)繁育后代，在子代的基因組中檢測到病毒基因組的序列，試驗證明了病毒基因組能與雞基因組發(fā)生融合。繼而在1989年Bosselman等[18]通過向雞胚中注射復(fù)制缺陷型病毒（replication defective virus），首次證實了該病毒可以將外源基因整合到雞的生殖細(xì)胞中，并且可遺傳給后代。Harvey等[19]以缺陷型ALV為載體，獲得了轉(zhuǎn)基因雞，通過CMV啟動子驅(qū)動具有表達(dá)生物活性的β-內(nèi)酰胺酶，在傳至第4代后仍在后代的卵清蛋白和血清中檢測到且其表達(dá)水平在不同子代中較接近。簡而言之，諸多成功實例證明了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法在制備轉(zhuǎn)基因雞方面前景廣闊。

2.3 利用慢病毒載體實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的介入和導(dǎo)向

慢病毒載體具有特別的優(yōu)點，即與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，首先其來源于慢病毒，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展成為一種基因操作方法。該方法擁有可感染分裂及非分裂期細(xì)胞的能力[20]，其他結(jié)構(gòu)類型簡單的病毒所缺乏的正是這項能力，再加上慢病毒載體對廣泛的宿主都有感受性，因而對轉(zhuǎn)基因操作而言是理想的工具。

剛開始部分研究小組成功獲得轉(zhuǎn)基因家禽，這主要是利用一些能導(dǎo)致腫瘤的病毒進行相關(guān)試驗而得到的。然而在獲得的家禽中有些會出現(xiàn)發(fā)育不表達(dá)，并常出現(xiàn)外源基因mRNA及蛋白表達(dá)效率偏低現(xiàn)象，導(dǎo)致了在后代中不容易檢測。目前慢病毒載體作為一種新的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其出現(xiàn)改變了這種現(xiàn)狀。2007年，Lillico等成功制備了轉(zhuǎn)基因雞，在該轉(zhuǎn)基因雞的輸卵管上皮細(xì)胞中能檢測到人源化單克隆抗體ScFv-Fc和重組人IFN-β-1a蛋白。在我國，科研人員經(jīng)過多年的努力，在運用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞的研究中也取得了顯著的成績，Liu等[21]獲得了輸卵管特異性表達(dá)人防御素4轉(zhuǎn)基因雞，Cao等[22]獲得了輸卵管特異性表達(dá)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因雞。

目前，在轉(zhuǎn)基因雞的制備中慢病毒載體介導(dǎo)法的應(yīng)用已經(jīng)非常成熟，并且Jon等[23]成功實現(xiàn)了對禽流感傳播的抑制，正是利用慢病毒載體獲得的小干擾RNAs（siRNAs）證實的。在轉(zhuǎn)基因雞制備研究中，慢病毒載體的優(yōu)點主要是其具有獨特的靈活性，同時具有巨大的應(yīng)用價值，并且在該領(lǐng)域占據(jù)了一定位置。

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