篤斯越桔腋芽初代培養(yǎng)技術(shù)研究

蔡柯 賈昊 姜茹桐 崔強(qiáng) 馬貴義 建德鋒

【摘 要】為了縮短篤斯越桔的育苗周期，采用其腋芽進(jìn)行組培技術(shù)育苗，該試驗(yàn)主要針對(duì)其初代培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果得出：采集篤斯越桔的腋芽，經(jīng)過(guò)消毒后接種到MS+KT 0.6 mg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d，挑選生長(zhǎng)健壯的愈傷組織切成0.5cm小塊，轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L或MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)分化出大量不定芽，然后利用這些不定芽作為中間繁殖體材料進(jìn)行繼代。

【關(guān)鍵詞】篤斯越桔;愈傷組織誘導(dǎo);不定芽誘導(dǎo)

篤斯越桔，學(xué)名為Vaccinium uliginosum Linn，又被稱為篤斯、黑豆樹（大興安嶺）、都柿（小興安嶺、伊春）、甸果、蛤塘果（吉林），訥日蘇（蒙古族語(yǔ)）等，是杜鵑花科 （Ericaceae） 越桔屬 （Vaccinium） 多年生落葉灌木， 一般高度為50～80cm， 果實(shí)為藍(lán)紫色小漿果[1]，現(xiàn)被認(rèn)為是野生藍(lán)莓的原種，也稱野生藍(lán)莓。該植物一般高0.5～1 m （生于高山的植株一般僅高10～15cm ），多分枝，葉多數(shù)，散生，葉片紙質(zhì)，倒卵形，橢圓形至長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)1～2.8 cm，寬0.6～1.5 cm，頂端圓形，有時(shí)微凹，基部寬楔形或楔形，全綠，表面近于無(wú)毛，背面微被柔毛，中脈、側(cè)脈和網(wǎng)脈均纖細(xì)，在表面平坦，在背面突起，葉柄短，長(zhǎng)12 mm，被微毛?；ü诰G白色，漿果近球形或橢圓形，直徑約1 cm，成熟時(shí)藍(lán)紫色，被白粉。花期6月，果期7～8月。主要產(chǎn)于大興安嶺北部（黑龍江、內(nèi)蒙古）、吉林長(zhǎng)白山。篤斯越桔的果實(shí)大小與大豆粒相當(dāng)，酸甜，味佳，可用以釀酒及制果醬，也可制成飲料，是一種集營(yíng)養(yǎng)、保健、天然于一身的多功能保健水果，蘊(yùn)含著巨大潛在的經(jīng)濟(jì)效益。吉林省長(zhǎng)白山余脈實(shí)生選種是目前選育果樹新品種的有效途徑之一，但其為異花授粉果樹，實(shí)生后代易出現(xiàn)變異，隨著離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，快速、高效、保優(yōu)的特點(diǎn)，嘗試采用組培技術(shù)進(jìn)行篤斯越桔繁育具有重要意義，本試驗(yàn)嘗試通過(guò)以腋芽作為外植體， 在不同激素組合的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，針對(duì)初代培養(yǎng)階段技術(shù)進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步的組培育苗打下基礎(chǔ)，以滿足市場(chǎng)需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2017年12月～2018年3月在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院花卉組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，篤斯越桔外植體采集于小白山（長(zhǎng)白山余脈），挑選生長(zhǎng)健壯無(wú)病害的篤斯越桔植株，從上采取若干帶腋芽莖段包裝好帶回組織培養(yǎng)室備用。

1.2 試驗(yàn)儀器及藥品

高壓滅菌鍋（沈陽(yáng)科瑞永興化玻璃儀器有限公司）、電冰箱（美歌電器有限公司）、超凈工作臺(tái)（蘇潔凈化設(shè)備公司）、干燥箱（中國(guó)科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所）、電子天平（長(zhǎng)春長(zhǎng)衡電子衡器有限公司）、攪拌儀（蘇州奇樂(lè)電子科技有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（優(yōu)尼克環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備有限公司）等儀器;MS大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分所需各種藥品，NAA、6-BA、KT等生長(zhǎng)激素，84消毒液、升汞、酒精等消毒液。以上儀器及藥品均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基本培養(yǎng)基及添加成分 初代培養(yǎng)分為兩個(gè)階段進(jìn)行，先形成愈傷組織，再在愈傷組織的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)不定芽[2-3]。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基分為4個(gè)配比，分別記作：A1：MS+KT1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L;A2：MS+KT1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L;A3：MS+KT0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L;A4：MS+KT0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為5個(gè)配比，分別記作：J1：MS+KT0.2 mg/L;J2：MS+KT0.4 mg/L;J3：MS+KT0.6 mg/L;J4：MS+KT0.8 mg/L;J5：MS+KT1.0 mg/L。以上配方均采用固體培養(yǎng)基，添加7 g/L瓊脂，30 g/L蔗糖，配方pH調(diào)整為5.8～6.0[4-6]。

1.3.2 外植體消毒及接種 將采集回來(lái)的帶腋芽莖段帶到實(shí)驗(yàn)室，截成2～3cm長(zhǎng)的小段，在準(zhǔn)備室內(nèi)先用流水沖洗20 min，瀝干水后放入0.1%升汞溶液中消毒5～8min，倒去消毒液，用蒸餾水沖洗3～4次，然后用0.5%的84消毒液浸泡15min，再次用蒸餾水沖洗干凈，瀝干水后放入接種室的超凈工作臺(tái)面?zhèn)溆?。接種前在超凈工作臺(tái)內(nèi)再次臺(tái)內(nèi)消毒，將腋芽從莖段上切離，切割為0.5cm大小，接種到4種愈傷組織培養(yǎng)基上。

1.3.3 初代培養(yǎng) 外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上之后，放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，注意觀察每個(gè)配方中愈傷組織出現(xiàn)的時(shí)間，到接種后第25d時(shí)，總體統(tǒng)計(jì)各配方愈傷組織形成瓶數(shù)，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。待愈傷組織長(zhǎng)成結(jié)構(gòu)致密、深綠色時(shí)，在超凈臺(tái)內(nèi)切割成0.5cm小塊，分別接種到4類芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種愈傷組織3小塊，每種配方接種20瓶，然后再次放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，注意觀察芽誘導(dǎo)情況，記錄形成芽的時(shí)間，統(tǒng)計(jì)平均形成芽的數(shù)量，30 d后計(jì)算芽的分化系數(shù)。整個(gè)初代培養(yǎng)過(guò)程中，溫度控制在16～25℃，光照度2000～3000 Lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

切割好的腋芽接種到4種不同的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上之后，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間及25d后計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

由結(jié)果可見，4種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均誘導(dǎo)出了愈傷組織，但在愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間及愈傷組織誘導(dǎo)率方面，各有不同，A4出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間最早[7]，A3愈傷組織誘導(dǎo)率最大，說(shuō)明KT的添加量與愈傷組織的分化相關(guān)，添加量多不利于愈傷組織的形成，添加量少有利于愈傷組織的形成。在4個(gè)配方中，A3形成的愈傷組織質(zhì)量最好，愈傷組織誘導(dǎo)階段的主要目的是形成更多的愈傷組織，綜合比較，A3配方比其他配方適合，另保持愈傷組織塊致密結(jié)實(shí)，這樣有利于切割后誘導(dǎo)不定芽，因此，4個(gè)配方中，篤斯越桔腋芽愈傷組織誘導(dǎo)的最佳配方應(yīng)該為MS+KT 0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L。

2.2 不定芽誘導(dǎo)分化情況

2.2.1 不同培養(yǎng)基上分化系數(shù) 愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽分化培養(yǎng)基上，均分化形成了不定芽，到轉(zhuǎn)瓶第30d統(tǒng)計(jì)每個(gè)配方的分化率。5個(gè)不定芽分化培養(yǎng)基中，均分化除了不定芽，且5個(gè)配方的分化率均大于50%。但在5個(gè)配方中的誘導(dǎo)情況存在一定的差異，J2培養(yǎng)基中分化率最高，達(dá)到80%，其次為J3、J4、J1、J5相對(duì)較低[8]。說(shuō)明配方中KT植物激素的配比對(duì)分化率有一定的影響，KT 0.4 mg/L對(duì)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)有一定促進(jìn)作用，較0.8 mg/L誘導(dǎo)效果好，KT的量為0.2 mg/L、0.6 mg/L或者1.0 mg/L，對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響不大，三者之間沒(méi)有較大的差異。就分化率來(lái)說(shuō)，綜合比較得出J2分化效果最好。

2.2.2 已分化培養(yǎng)基上分化情況 體現(xiàn)的是分化瓶數(shù)多少，但最終形成的不定芽數(shù)量及分化速度也對(duì)今后的擴(kuò)繁有較大影響，

觀定期察記錄差距較大，另分化的速度也不同?？煽闯?，J2、J4形成不定芽的時(shí)間比較早，J2形成在轉(zhuǎn)接后的第20 d，J4形成在轉(zhuǎn)接后的第21 d，比J1、J3、J5均早，J1、J3、J5出現(xiàn)在轉(zhuǎn)接后的第26 d及第25 d。從平均分化出不定芽的個(gè)數(shù)來(lái)看，J2（MS+KT0.4 mg/L）配方最多，其次為J4（MS+KT 0.8 mg/L）配方。結(jié)合圖3-1，可以得出J2、J4配方較優(yōu)，形成不定芽的時(shí)間較早、分化不定芽的數(shù)量多。綜合得出，在4個(gè)不定芽分化培養(yǎng)基配方中，J2（MS+KT0.4 mg/L ）、J4（MS+KT 0.8 mg/L）配方均適合篤斯越桔愈傷組織塊進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。

3 ?結(jié)論與討論

通過(guò)篤斯越桔腋芽愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，得出MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L配方效果最好，誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)率最高;通過(guò)比較不定芽分化情況，得出在添加1.0 mg/L 6-BA的情況下，NAA的量添加到0.2mg/L均為好，結(jié)果得出：選用篤斯越桔的帶腋芽莖段，經(jīng)過(guò)消毒后，在超凈臺(tái)下將腋芽切割成0.5cm大小，每瓶培養(yǎng)基接種1個(gè)腋芽的方式接種到MS+KT0.4 ?mg/L培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出愈傷組織，然后將愈傷組織切塊轉(zhuǎn)入MS+KT0.4 mg/L或MS+KT 0.8mg/L培養(yǎng)基上，分化出多數(shù)量的不定芽，然后利用這些不定芽以進(jìn)一步擴(kuò)繁。由于時(shí)間和精力關(guān)系，本試驗(yàn)關(guān)于繼代、生根階段的配方及出瓶后的影響等并未探討，還有待于進(jìn)一步的研究。

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