超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖的工藝優(yōu)化

秦令祥，周婧琦，崔勝文，高愿軍

（1.漯河中德雙成功能食品研究院有限公司，河南漯河462300；2.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南漯河462300）

香菇（Lentinus edodes）亦稱香蕈、花菇、冬菇，為擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、香菇屬的子實(shí)體，是世界上第二大食用菌種[1]，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有很高的藥用價(jià)值，是一種集營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用功效于一體的藥食兩用真菌[2]，廣泛分布我國(guó)各省區(qū)，在我國(guó)有悠久的食用歷史，被譽(yù)為“菇中之王”，“菌中皇后”[3]，是人類理想的健康食品。香菇多糖（lentinan，LNT）是從香菇的子實(shí)體中分離純化得到的高分子葡聚糖，主要成分為葡萄糖。香菇多糖是香菇中最重要的一種生物活性物質(zhì)，是一種重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)免疫[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤、降血糖等作用，目前，已廣泛應(yīng)用于人的臨床治療[6-10]。

目前，香菇多糖的提取方法多為傳統(tǒng)的熱水浸提法，該方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率不高的缺點(diǎn)[11]。酶法和超聲波法有效避免了熱水浸提的缺陷，酶具有水解纖維素和糖蛋白的作用，促進(jìn)胞內(nèi)有效成分的溶出[12]。超聲波是利用其空化作用、機(jī)械效應(yīng)及機(jī)械剪切作用對(duì)原料進(jìn)行破碎，使胞內(nèi)的有效成分?jǐn)U散、溶出[13]。本試驗(yàn)采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖，達(dá)到提高多糖提取率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇：丹尼斯超市；葡萄糖、苯酚、硫酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、正丁醇、三氯甲烷、無(wú)水乙醇（分析純）：成都科龍化工試劑廠；纖維素酶（20 000 U/g）、果膠酶（20 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2450島津紫外可見分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；TDL-50B臺(tái)式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-M4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海赫田科學(xué)儀器有限公司；BSA124S電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；WN-20萬(wàn)能粉碎機(jī)：廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；FRE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DZF-6090真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：常州澳華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香菇粉的制備

將從超市中購(gòu)得的干香菇在80℃烘箱中干燥至恒重，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目的篩網(wǎng)，得到符合條件的香菇粉，備用。

1.3.2 香菇多糖的超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取工藝及操作要點(diǎn)

1.3.2.1 提取工藝流程

香菇粉→超聲波提取→調(diào)節(jié)pH值→復(fù)合酶提取→滅酶→離心（5 000 r/min，10 min）→上清液減壓濃縮→加3倍體積95%乙醇溶液沉淀→4℃靜置24 h→離心（5 000 r/min，10 min）→真空干燥→即得香菇粗多糖

1.3.2.2 操作要點(diǎn)

稱取1.000 g香菇粉，按一定的料液比加入蒸餾水，進(jìn)行超聲波提??；超聲后加入緩沖液用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH值，按質(zhì)量比1∶1∶1加入纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶，水浴恒溫提取60 min后，90℃滅酶10 min；5 000 r/min下離心10 min，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，濃縮液加3倍體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液，在4℃條件下靜置24 h，5 000 r/min下離心10 min后收集沉淀，再經(jīng)真空干燥箱干燥即得香菇粗多糖。

1.3.3 香菇多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法[14]測(cè)定香菇多糖含量。

1.3.4 多糖提取率的計(jì)算

多糖提取率根據(jù)下列公式計(jì)算。

式中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為香菇干粉質(zhì)量，g。

1.3.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 超聲波提取工藝條件的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的香菇粉5份，在超聲波400W，料液比分別為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），超聲溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃，超聲時(shí)間分別為4、8、12、16、20 min 的條件下提取香菇多糖，以多糖提取率為指標(biāo)，考察不同料液比、超聲溫度及超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。每組進(jìn)行3次平行測(cè)定，所得結(jié)果為3次測(cè)定的平均值。

1.3.5.2 超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取工藝條件的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的香菇粉5份，經(jīng)超聲波提取后，利用磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值分別為 4、4.5、5、5.5、6，加入復(fù)合酶（木瓜蛋白酶：纖維素酶：果膠酶質(zhì)量比為1∶1∶1）分別為 1%、1.5%、2%、2.5%、3%，在酶解溫度分別為 40、50、60、70、80℃的條件下分別酶解 20、30、40、50、60 min，提取香菇多糖，以多糖提取率為指標(biāo)，考察酶解pH值、復(fù)合酶添加量、酶解溫度及酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)香菇多糖提取率的影響

料液比對(duì)香菇多糖提取率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著料液比的減小，多糖提取率先升高再降低，當(dāng)料液比1∶15（g/mL）時(shí)，香菇多糖提取率達(dá)到最高。料液比較低時(shí)，溶液濃度和黏稠度過(guò)大，香菇細(xì)胞得不到充分的超聲波的空化作用，多糖提取不完全；而料液比過(guò)大時(shí)，超聲波的能量大部分被溶劑吸收，香菇細(xì)胞內(nèi)的多糖成分溶出較少，提取率降低。因此，本研究的最佳料液比為1∶15（g/mL）。

2.1.2 超聲溫度對(duì)香菇多糖提取率的影響

超聲溫度對(duì)香菇多糖提取率的影響見圖2。

圖1 料液比對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the extraction rate

圖2 超聲溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate

由圖2可知，隨著超聲溫度的不斷升高，多糖提取率也不斷升高，當(dāng)超聲溫度達(dá)到80℃，香菇多糖提取率達(dá)到最高，再進(jìn)一步升高超聲溫度，多糖提取率也不再升高，反而有所降低。分析其原因可能為超聲溫度升高，多糖的溶解度也升高，當(dāng)超聲溫度升高到一定程度后，部分多糖發(fā)生水解，造成提取率略有降低。因此，本研究的最佳超聲溫度為80℃。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的不斷增加，多糖提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為12 min時(shí)，香菇多糖提取率達(dá)到最高，當(dāng)超聲時(shí)間再繼續(xù)增加，多糖會(huì)在超聲波的空化、機(jī)械剪切和熱作用下發(fā)生破壞和分解，促使多糖提取率降低。因此，本研究選擇最佳的超聲時(shí)間為12 min。

2.1.4 超聲波提取香菇多糖最佳工藝參數(shù)的確定

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為試驗(yàn)因素，選取L9（33）進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討超聲波提取香菇多糖工藝的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal experimental design

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results

由表2正交試驗(yàn)分析可知，各因素對(duì)香菇多糖提取率的影響大小順序?yàn)椋篈＞B＞C，即料液比＞超聲溫度＞超聲時(shí)間，最優(yōu)組合為A2B1C2。

由表3的方差分析可知，在顯著水平P=0.05時(shí)，料液比、超聲溫度和超聲時(shí)間這3個(gè)因素影響均不顯著，經(jīng)對(duì)R值的分析，超聲波法提取香菇多糖的最佳工藝條件組合為 A2B1C2，即料液比為 1 ∶15（g/mL），超聲溫度70℃，超聲時(shí)間12 min，在此最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)的香菇多糖提取率平均值為8.97%。

2.2 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在超聲波提取香菇多糖的最優(yōu)提取條件下，進(jìn)一步協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖，以期提高多糖的提取率。

2.2.1 酶解pH值對(duì)香菇多糖提取率的影響

酶解pH值對(duì)香菇多糖提取率的影響見圖4。

圖4 酶解pH值對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH value on the extraction rate

由圖4可知，隨著酶解pH值的升高，多糖提取率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶解pH值為5.5時(shí)，香菇多糖提取率達(dá)到最高，繼續(xù)升高pH值，多糖提取率反而降低。分析可能的原因是pH值是影響酶活性的一個(gè)重要因素，在高于最適pH值范圍時(shí)，酶的活性降低，導(dǎo)致提取率降低。因此，本研究選擇最佳的酶解pH值為5.5。

2.2.2 酶解溫度對(duì)香菇多糖提取率的影響

酶解溫度對(duì)香菇多糖提取率的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate

由圖5可知，多糖提取率隨著酶解溫度的升高，呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，香菇多糖提取率達(dá)到最高，之后繼續(xù)升高酶解溫度，多糖提取率反而降低。分析可能的原因是酶解溫度的升高，促使酶活性加強(qiáng)，有利于多糖的溶出；當(dāng)酶解溫度高于一定范圍時(shí)，導(dǎo)致部分酶活性降低，提取率降低。因此，本研究選擇最佳的酶解溫度為60℃。

2.2.3 復(fù)合酶添加量對(duì)香菇多糖提取率的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)香菇多糖提取率的影響見圖6。

圖6 復(fù)合酶添加量對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of compound enzyme addition on the extraction rate

由圖6可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，多糖提取率逐步升高，當(dāng)復(fù)合酶添加量超過(guò)2.5%時(shí)，香菇多糖提取率并沒(méi)有顯著升高。這可能是由于復(fù)合酶添加量低于最佳值時(shí)，酶解不徹底，多糖溶出的少；而復(fù)合酶添加量大于最佳值時(shí)，溶液已飽和，多糖基本溶出完全，提取率不再升高。因此，本研究選擇最佳的復(fù)合酶添加量為2.5%。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響見圖7。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis time on the extraction rate

由圖7可知，隨著酶解時(shí)間的增加，多糖提取率逐步升高，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，香菇多糖提取率達(dá)到最大，再進(jìn)一步增加酶解時(shí)間，提取率也不會(huì)升高反而有所降低。這可能是由于酶解時(shí)間過(guò)短，酶解不充分，多糖溶出不徹底；而酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，導(dǎo)致多糖發(fā)生水解，造成提取率降低。因此，本研究選擇最佳的酶解時(shí)間為50 min。

2.2.5 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖最佳工藝參數(shù)的確定

在超聲波提取香菇多糖正交試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、酶解時(shí)間、復(fù)合酶添加量、酶解pH值這4個(gè)因素，選取L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖工藝的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表5，方差分析見表6。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factor levels table of orthogonal experimental design

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of orthogonal experimental design

表6 方差分析結(jié)果Table 6 The variance analysis results

由表5正交試驗(yàn)分析可知，各因素對(duì)香菇多糖提取率的影響大小順序?yàn)椋築＞D＞A＞C，最優(yōu)組合為B2D3A2C2。

由表6可以看出，在顯著水平P=0.05時(shí)，酶解時(shí)間和復(fù)合酶添加量對(duì)香菇多糖的提取率影響較大，達(dá)到了顯著水平，其他因素的影響不顯著，經(jīng)對(duì)R值的分析，超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖的最佳工藝條件組合為B2D3A2C2，即酶解時(shí)間50 min，復(fù)合酶添加量3%，酶解溫度60℃，酶解pH值5.5。

2.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)通過(guò)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件進(jìn)行最優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)的超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖的提取率平均值為12.46%，顯著高于其他條件下的香菇多糖提取率。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖，可顯著提高香菇多糖提取率，此方法具有快速、高效、操作簡(jiǎn)便、節(jié)能等特點(diǎn)。我們通過(guò)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)，得到超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖的最佳工藝條件為：料液比為1∶15（g/mL），超聲溫度70℃條件下超聲提取12 min后進(jìn)行復(fù)合酶法提取，酶解時(shí)間50 min，復(fù)合酶添加量3%，酶解溫度60℃，酶解pH值5.5，該條件下香菇多糖提取率為12.46%。因此，本研究得到的工藝可為香菇多糖的工廠化生產(chǎn)以及多糖化合物的綜合利用提供一種新的途徑。