響應(yīng)面法優(yōu)化酶解單環(huán)刺螠內(nèi)臟多肽的工藝研究

張曉曉，劉峰，劉春娥，紀(jì)元，段冬，閆娜

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東煙臺264670）

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus），俗稱海腸子，屬于螠蟲動物門、無管螠目、刺螠科。在我國單環(huán)刺螠主要分布于山東膠東地區(qū)潮間帶下區(qū)，在俄羅斯、朝鮮、日本等地也有分布[1]。近年來隨著單環(huán)刺螠養(yǎng)殖技術(shù)的完善，其消費(fèi)市場日益增大。單環(huán)刺螠的體壁肌是主要的食用部分，而占整體重量68%（濕重比）的內(nèi)臟往往被丟棄，然而內(nèi)臟中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)18.25%，脂肪含量為0.12%，總糖含量為4.09%，且含有豐富的Ca、Mg、Fe、Zn等元素：同時也含有豐富的二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA） 和二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）[2-3]，其支芳值與人體支芳值相似，能被人體很好的吸收利用。海洋生物處于高壓、高鹽、低溫、寡營養(yǎng)等環(huán)境[4]，為了適應(yīng)這些極端的海洋生境，生物自身的功能分子組成或結(jié)構(gòu)都與陸生生物的功能分子有很大的不同[5-6]。因此，對單環(huán)刺螠內(nèi)臟的開發(fā)利用，不僅提高了其附加值，而且極有可能開發(fā)出具有一定功能的生物活性物質(zhì)。

目前，國內(nèi)外對單環(huán)刺螠內(nèi)臟的研究主要集中在內(nèi)臟中營養(yǎng)成分測定及多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)研究方面[7-10]。對其豐富的蛋白質(zhì)資源及其可制備活性肽的研究目前尚未見報道。饒勝其等[8]以廣昌白蓮為原料，采用堿性蛋白酶酶解得到多肽。張紅波等[9]以鯉魚魚肉為原料，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法對鯉魚多肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，確定胃蛋白酶提取鯉魚多肽時的最佳工藝參數(shù)。不同的蛋白酶作用的氨基酸位點(diǎn)并不相同，因此雙酶復(fù)合可以用比單酶試驗中更少的加酶量，更短的酶解時間取得更好的酶解效果[10-11]。方富永等[12]研究木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶雙酶復(fù)合水解酪蛋白，其酶解效果明顯優(yōu)于單酶酶解。

本文以單環(huán)刺螠內(nèi)臟為原料，選用中性蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行雙酶配比、酶解時間、總加酶量、酶解溫度四因素六水平的雙酶復(fù)合單因素試驗，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，運(yùn)用Design Expert8.0.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以多肽得率為響應(yīng)值，研究加酶量、時間、溫度對單環(huán)刺螠內(nèi)臟多肽得率的影響，最終得到單環(huán)刺螠內(nèi)臟多肽的最佳酶解工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單環(huán)刺螠內(nèi)臟：煙臺萊山區(qū)農(nóng)貿(mào)市場；中性蛋白酶（6萬U/g）、胰蛋白酶（25萬U/g）、胃蛋白酶（3500U/mg）、木瓜蛋白酶（80萬 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g）：北京索萊寶科技公司；其他試劑均為分析純；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BHS-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：龍口市先科技公司。

1.2 方法

1.2.1 單環(huán)刺螠內(nèi)臟勻漿液制備

將單環(huán)刺螠內(nèi)臟用蒸餾水淋洗后進(jìn)行組織絞碎，紗布過濾，得勻漿液。

1.2.2 單環(huán)刺螠內(nèi)臟酶解工藝

1.2.2.1 雙酶復(fù)合單因素試驗

以下試驗均進(jìn)行3次重復(fù)。

1）雙酶配比對水解度的影響

向料液比1∶10（g/mL）的勻漿液中按照 10∶3、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶1.5、1 ∶2、1 ∶5（中性蛋白酶 ∶堿性蛋白酶）的質(zhì)量比，總加酶量為3%，在50℃水浴中酶解2 h（pH 7.5）后取樣，滅酶備用。

2）酶解時間對水解度的影響

將勻漿液按料液比 1∶10（g/mL），雙酶配比 1∶1（質(zhì)量比），總加酶量3%，混勻調(diào)節(jié)pH 7.5，于50℃水浴中酶解，在 1、2、3、4、5 h 取樣，滅酶備用。

3）總加酶量對水解度的影響

將勻漿液按料液比 1∶10（g/mL）混勻，雙酶配比 1∶1（質(zhì)量比），分別按1%、2%、3%、4%、5%的總加酶量混勻，調(diào)節(jié)pH 7.5，50℃水浴酶解4 h后取樣，滅酶備用。

4）酶解溫度對水解度的影響

將勻漿液按料液比 1∶10（g/mL），總加酶量 3%，雙酶配比 1∶1（質(zhì)量比）混勻，調(diào)節(jié) pH 7.5，分別在 35、40、45、50、55℃水浴中酶解2 h后取樣，滅酶備用。

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

將雙酶復(fù)合試驗中的4因素結(jié)果用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行回歸線性分析，選取3個影響度較大的因素，用Design-Export.8.05模擬多元響應(yīng)面回歸模型，其三因素三水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平編碼表Tabel 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in the response surface analysis

1.2.3 水解度的測定

以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用茚三酮法測定樣品中的氨基酸含量，計算水解度[13]：

式中：m為氨基酸質(zhì)量，g；m0為樣品質(zhì)量g。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶復(fù)合單因素試驗結(jié)果

不同蛋白酶的酶活力、與底物之間的相互作用及作用位點(diǎn)等的不同，導(dǎo)致不同的酶對同一底物的酶解效果產(chǎn)生明顯差異[14-15]。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的催化基團(tuán)分別是絲氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸或色氨酸、精氨酸或賴氨酸、半胱氨酸[16-17]。單環(huán)刺螠蛋白質(zhì)中甘氨酸和絲氨酸的含量較高于其他氨基酸[18]，這解釋了單因素試驗中堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果優(yōu)于其他酶的原因。且中性蛋白酶和堿性蛋白酶的pH值與效用最適溫度相差不大[19]，這為雙酶復(fù)合試驗提供了條件。

雙酶配比對水解度的影響見圖1。

圖1 雙酶配比對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme ration on degree of hydrolysis

由圖1可以看出，雖然總的加酶量相同，但不同的配比對應(yīng)的水解度也存在一定的差異，當(dāng)中性蛋白酶：堿性蛋白酶為2∶1時對應(yīng)的水解度最大（12.48%）。

總加酶量對水解度的影響如圖2所示。

圖2 加酶量對水解度的影響Fig.2 Effect of protease addition on degree of hydrolysis

隨著加酶量的增加，氨基酸含量不斷上升，當(dāng)加酶量達(dá)到3%時，氨基酸含量達(dá)到峰值。加酶量低時，底物濃度遠(yuǎn)高于加酶量，隨著酶濃度的增加，中性蛋白酶和堿性蛋白酶充分作用于底物，水解度逐漸增大至最大值[18-19]。而當(dāng)加酶量超過一定限值時，底物濃度小于酶添加量，樣品中的酶相互之間競爭單環(huán)刺螠中的蛋白質(zhì)，并發(fā)生自溶，降低了蛋白酶的酶活力，導(dǎo)致氨基酸含量呈現(xiàn)下降趨勢[20-21]。因此理論上水解度的最大值應(yīng)該出現(xiàn)在加酶量為2%～4%之間，在此范圍內(nèi)既可以節(jié)省酶的消耗，又能達(dá)到較好的酶解效果。

酶解時間對水解效果的影響如圖3所示，隨著酶解時間的增加，水解度呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，在3 h時水解度最高。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

酶解時間短，原料中的蛋白質(zhì)分解量較少，而酶解時間過長，酶的活性在水浴溫度下會產(chǎn)生一定的損失[19-21]。有研究表明，在酶解過程中水解度呈現(xiàn)出3個階段：增長階段，穩(wěn)定階段，輕微下降階段，其中穩(wěn)定階段多肽含量最高[22]。國內(nèi)外許多酶法制備海洋生物活性肽的研究已證實這種蛋白酶解曲線的趨勢，與本試驗結(jié)果相符。酶解溫度對水解度的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis

如圖4，隨著酶解溫度的升高，水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)酶解溫度為45℃時，獲得的水解度最大。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，升高溫度可使酶的溶解度及酶分子的擴(kuò)散速度增加[23]，但溫度高于酶的最適溫度后會破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，使酶產(chǎn)生不可逆性失活[24-25]。因此理論上水解度的最大值應(yīng)該出現(xiàn)在酶解溫度為40℃～50℃之間，與中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適作用溫度相差較小。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗結(jié)果分析

用SPSS Statistics 17.0對加酶量、溫度、時間、雙酶配比進(jìn)行線性回歸顯著性分析見表2。

表2 SPSS顯著性分析系數(shù)表Tab.2 Table of SPSS significance analysis

由表2得回歸方程Y=2.259X1+0.019X2+1.015X3+0.009X4，各因素的影響大小為：加酶量>酶解時間>酶解溫度>雙酶配比。

選取前3個因素，用Design-Export.8.05模擬多元響應(yīng)面回歸模型見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計試驗回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

經(jīng)過ANOVA分析得二次響應(yīng)面回歸方程如下：水解度Y=-136.435 25+7.490 7A+11.903 2B+5.570 20C-0.202 50AB+0.080 000AC-0.076 000BC-1.608 25A2-1.243 25B2-0.063 030C2

由表3得出，模型的P＜0.01，模型達(dá)到極顯著。模型失擬項P＞0.05，不顯著，模型的絕對系數(shù)R2=0.981 6，說明該模型能解釋98.16%的響應(yīng)值變化，表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，該模型擬合程度較好，表示模型預(yù)測值與實際誤差值較小，可以用此模型來預(yù)測真實值。自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。各因素的影響大小為總加酶量＞酶解時間＞酶解溫度，與SPSS分析的雙酶復(fù)合試驗相符合。馬井喜等[26]的研究中，也發(fā)現(xiàn)溫度對水解度的影響最小，與試驗結(jié)果相符。為了更加直觀的分析相關(guān)變量間的交互作用，根據(jù)響應(yīng)面曲線圖進(jìn)一步分析。

各因素間的交互效應(yīng)以及對水解度的影響見圖5。

從圖5a可以看出，酶解時間不變，水解度隨著總加酶量的增加先增加后減小。在底物濃度一定時，加大酶的添加量，蛋白酶對單環(huán)刺螠的酶解作用加強(qiáng)，水解度有所提高：當(dāng)溶液中的蛋白酶濃度大過底物濃度時，蛋白酶自身發(fā)生水解，反而使水解度有所下降：當(dāng)總的加酶量不變時，隨著酶解時間的增加水解度的變化趨勢與加酶量的影響趨勢一致。隨著酶解溫度的升高（如圖5b），溶液的溫度達(dá)到蛋白酶的最適溫度，蛋白酶活力增強(qiáng)，水解度增大，隨著溫度的繼續(xù)升高超過了最適溫度，酶活力下降從而導(dǎo)致水解度下降。圖5c表示酶解時間和溫度的交互影響，其結(jié)果與圖5a、圖5b一致。總體來看，各因素的降維分析均是先增加后減小的趨勢。響應(yīng)值在中間區(qū)域取得最大，水解度最高。其中總加酶量和酶解時間的交互效應(yīng)最顯著。由以上分析可知，在各因素中心點(diǎn)附近水解度最高，回歸方程具有最優(yōu)水平。

2.3 最佳提取條件的確定和驗證

由Design-Export 8.0的Numerical分析可得最佳水解條件：加酶量3.22%，酶解時間3.17 h，溫度44.3℃，可得到最高水解度17.984%，實際試驗，重復(fù)3次，所得水解度為（17.79±0.62）%。陳秀琴對鮑魚內(nèi)臟進(jìn)行酶解，其酶解產(chǎn)物的最佳水解度為10.2%[27]，海參內(nèi)臟中的蛋白質(zhì)含量為52.57%，酶解的最佳水解度為33.12%[28]。本試驗中，單環(huán)刺螠內(nèi)臟的蛋白質(zhì)含量為18.25%[29]，通過響應(yīng)面法酶解水解度可達(dá)17.79%：可見采用此方法可達(dá)到較好的水解效果。

3 結(jié)論

各因素對水解效果的影響大小為：加酶量＞酶解時間＞酶解溫度＞雙酶配比，在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取影響效果較強(qiáng)的3個因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法對單環(huán)刺螠內(nèi)臟酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。在試驗所得最佳條件下，水解度可達(dá)（17.79±0.62）%，而單環(huán)刺螠內(nèi)臟中的蛋白質(zhì)含量為18.25%，可見此方案的酶解效果較好，響應(yīng)面分析探索出了單環(huán)刺螠內(nèi)臟多肽的較佳提取工藝。目前對于單環(huán)刺螠內(nèi)臟蛋白質(zhì)資源及其可制備活性肽的研究還處在初期研究階段，本文通過響應(yīng)面法探索出最佳酶解工藝，將廢棄內(nèi)臟中的大分子蛋白質(zhì)變?yōu)樾》肿影被峒岸嚯模诳蒲蟹矫?，為探索單環(huán)刺螠內(nèi)臟多肽的提取及其生物活性的研究作基礎(chǔ)，具有一定的借鑒意義；在工業(yè)方面的應(yīng)用，可作為飼料添加劑、植物肥料添加劑、食品添加劑等，也為單環(huán)刺螠的深加工、大規(guī)模生產(chǎn)及其應(yīng)用提供新思路。