籽瓜瓤提取物對酪氨酸酶抑制作用及其成分分析

王磊，阿地里江·阿不都拉，張富春，劉軍

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆烏魯木齊830046）

籽瓜（Citrullus lanatus ssp.vulgaris var.Megalaspermus Lin et Chao）屬葫蘆科西瓜屬，普通西瓜的變種，主要產(chǎn)于中國，分布于新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、青海等地[1-2]。新疆是籽瓜最大的種植區(qū)，是農(nóng)戶增收的重要經(jīng)濟作物之一[3-4]，僅2015年新疆籽瓜種植就有600萬畝[5-6]。籽瓜中含有豐富的維生素、多糖、果膠、L-瓜氨酸等具有保健及抗衰老，增強免疫力的有效成分。除此之外，籽瓜作為抗炎消暑品食用時，由于其含糖量低，適合高血壓、糖尿病、高血脂等人群，具有重要的開發(fā)價值[7]。但目前大量籽瓜均用于取籽，而剩余的95%左右的瓜瓤往往被廢棄，造成了很大的資源浪費和環(huán)境污染[8]。雖然有部分研究基于籽瓜活性成分已進(jìn)行，但其綜合利用率依然很低；籽瓜對酪氨酸酶抑制性的相關(guān)研究卻鮮有報道，故我們對其不同極性及不同制備方式提取物進(jìn)行酪氨酸酶活性抑制篩選，并對活性成分進(jìn)行分析，以期增加籽瓜綜合利用價值和附加產(chǎn)值。

酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是一種普遍存在于動物、植物、微生物和人體中的一種含銅離子的多酚氧化酶類，是定位于黑色素細(xì)胞中黑色素小體膜上的一種糖蛋白，主要負(fù)責(zé)外觀顏色[9-11]。在紫外線的照射下酪氨酸酶在特化的細(xì)胞器黑色素小體內(nèi)發(fā)生系列復(fù)雜的反應(yīng)將底物L(fēng)-酪氨酸催化生成黑色素，黑色素轉(zhuǎn)移至鄰近角質(zhì)細(xì)胞沉著后，呈現(xiàn)顏色[12-14]。酪氨酸酶作為黑色素生物合成中至關(guān)重要的酶，通常作為退黑劑的靶標(biāo)[15]。在過去的50年中，氫醌一直是治療色素沉著紊亂造成的雀斑、黑斑等皮膚疾病的黃金標(biāo)準(zhǔn)[16]，隨后又衍生出曲酸[17]、熊果苷、對苯二酚、壬二酸[18]等酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用。近年對天然活性成分篩選酪氨酸酶抑制劑的研究成為熱點，因此籽瓜作為新疆的大宗農(nóng)作物，進(jìn)行相關(guān)研究十分必要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜材料，2016年9月采集于新疆省阜康市上戶溝鄉(xiāng)。

L-酪氨酸、酪氨酸酶、熊果苷：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、二甲基亞砜：天津永晟精細(xì)化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃硫酸、醋酐：天津市化學(xué)試劑三廠；3，5-二硝基苯甲酸、冰醋酸、香草醛：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；堿式乙酸鉛：洛陽市化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone冷凍干燥機：美國LABCONCO公司；京制00000246電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；D7031EASYpure II超純水儀：巴恩斯特德國際有限公司；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道爾夫公司；HH-SR數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；ELX808全自動酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料制備

1.3.1.1 籽瓜瓤凍干粉、烘干粉、鮮瓤的制備

1）凍干粉

取新鮮籽瓜，清洗，去青皮和籽，籽瓜瓤打漿，紗布過濾，瓤渣、清汁分離。將清汁旋蒸濃縮（50℃～55℃，轉(zhuǎn)速≥60 r/min），濃縮后的汁與瓤渣合并，混勻。放置在培養(yǎng)皿中凍干成粉，稱重，低溫避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

2）烘干粉

取新鮮籽瓜，清洗，將籽瓜瓤切片，于60℃烘箱中烘干，打粉稱重，低溫避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

3）鮮瓤

鮮瓜去青皮和籽的部分為鮮瓤。

1.3.1.2 籽瓜烘干粉、凍干粉、鮮瓤水提物制備

分別取凍干粉、烘干粉、鮮瓤 100 g，以 1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，于60℃水浴浸提2 h，5 000 r/min離心20 min收集上清，瓤渣繼續(xù)提取，反復(fù)提取3次合并上清液，上清經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮后真空冷凍干燥，得凍干粉、烘干粉、鮮瓤水提物浸膏備用。

1.3.1.3 籽瓜瓤凍干粉醇提物制備

分別取凍干粉 100 g 各 3 份，以 1∶20（g/mL）料液比分別加入30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇，于60℃水浴浸提2 h，5 000 r/min離心20 min收集上清，瓤渣繼續(xù)提取，反復(fù)提取3次合并上清液，將收集的上清旋轉(zhuǎn)濃縮后真空冷凍干燥，得凍干粉30%醇提物、60%醇提物、95%醇提物浸膏備用。

1.3.2 不同提取物的酪氨酸酶抑制活性測定

酪氨酸酶活性測定方法參照Baek等的研究并稍作修改[25]。

1.3.2.1 磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）

稱取磷酸二氫鈉7.16 g，去離子水溶解，定容至100 mL，得到溶液A。稱取磷酸氫二鈉3.12g，去離子水溶解定容至100 mL，得溶液B。分別精密量取A、B溶液各51 mL、49 mL，混合即得pH=6.8磷酸緩沖溶液。

1.3.2.2 酪氨酸酶溶液

所購置的酪氨酸酶規(guī)格為570 U/mg，精密稱取酪氨酸酶43.86 mg，迅速轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用磷酸緩沖液溶解并定容，4℃保存。

1.3.2.3 L-酪氨酸溶液

精密稱取L-酪氨酸18.10 mg至50 mL容量瓶中，用磷酸緩沖液溶解并定容。

1.3.2.4 熊果苷對照品溶液

精密稱取熊果苷20.20 mg，去離子水溶解，至10 mL容量瓶中定容。

1.3.2.5 樣品配制

在96孔板中配置空白組對照和樣品組，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處測定吸光度分別為AB、AD，再將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，迅速將孵育后空白組和樣品組測定490 nm處吸光度分別為AA、AC，按下式計算樣品對酪氨酸酶活性的抑制率。配置空白及樣品反應(yīng)液組成見表1。

式中：AA為空白組孵育后的吸光度值；AB為空白組孵育前的吸光度值；AC為樣品組孵育后的吸光度值；AD為樣品組孵育前的吸光度值。

表1 反應(yīng)液組成Table 1 Composition of reaction fluid

1.3.3 籽瓜瓤水提物定性定量分析

1.3.3.1 籽瓜瓤水提物定性分析

本試驗通過雙縮脲法[19]、α-萘酚法[20]、醋酐-濃硫酸法[21]、香草醛-濃鹽酸法[22]、三氯化鋁法[23]、堿性苦味酸反應(yīng)[24]等方法，定性分析籽瓜中蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸、還原糖、多糖和甙類、皂甙類、有機酸類、酚類化合物及鞣質(zhì)類、甾體及三萜類化合物、黃酮類化合物、強心甙類、蒽醌類、揮發(fā)油、油脂類、生物堿類、內(nèi)酯、香豆素及其甙類等成分是否存在。

1.3.3.2 籽瓜瓤主要成分定量分析

對籽瓜瓤中的糖類、有機酸等主要成分進(jìn)行定量，液相色譜法測定果糖、葡萄糖和蔗糖，以苯酚硫酸法檢測粗多糖含量，維生素C含量通過液相色譜，流動相為磷酸二氫鉀和十六烷基三甲基溴化銨、甲醇，流速為0.7 mL/min，檢測波長245 nm。有機酸（蘋果酸、檸檬酸）通過色譜法檢測，流動相0.1%磷酸、甲醇，流速0.5 mL/min，210 nm下檢測。參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)如下：GB/T 10782-2006《蜜餞通則》、GB 5009.8-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》、NY/T 2016-2011《水果及其制品中果膠含量的測定分光光度法》、GB 5009.88-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》、SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》、GB 5009.86-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測定》、GB 5009.157-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品有機酸的測定》。

1.3.4 籽瓜糖類、有機酸以及配比粗多糖有機酸對酪氨酸酶的抑制活性

籽瓜糖類、有機酸以及配比粗多糖有機酸對酪氨酸酶的抑制活性方法同1.3.2。

1.3.5 統(tǒng)計分析

GraphPrism.5.0軟件統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（Mean±SD）方式表示，以單因素方差（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗為3次獨立重復(fù)；***p＜0.001為極顯著性差異（與對照組比較），###p＜0.001為極顯著性差異（多糖有機酸混合物與凍干粉比較），具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽瓜瓤凍干粉不同極性提取物酪氨酸酶抑制活性

籽瓜凍干粉4種提取物對酪氨酸酶活性抑制作用見圖1。

圖1 籽瓜瓤不同極性提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp extracted by water

由圖1知，30%醇提物、60%醇提物、95%醇提物均呈濃度依賴的方式抑制酪氨酸酶活性，但其酪氨酸酶抑制活性較弱，抑制率均低于30%；其中水提物的酪氨酸酶抑制活性最強，濃度為50 mg/mL時達(dá)到50%以上，效果要優(yōu)于其他3種提取物，說明其起酪氨酸酶抑制活性的成分可能是水溶性物質(zhì)。

2.2 不同制備方式的籽瓜水提物酪氨酸酶抑制活性

凍干粉不同極性提取物酪氨酸酶抑制作用最好的是水提物，凍干成本高，因此考慮籽瓜瓤不同制備方式水提物的酶活抑制作用，結(jié)果見圖2。

通過試驗對比，由圖2可發(fā)現(xiàn)，烘干粉水提物酪氨酸酶抑制活性最強，凍干粉水提物次之，鮮瓜瓤水提物的效果最差，因此將進(jìn)一步研究加工成本較低的烘干粉水提物的抑制成分。

圖2 籽瓜瓤不同制備方式水提物對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.2 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp with lyophilized and ovendry power

2.3 籽瓜瓤烘干粉水提物成分定性、定量分析

2.3.1 籽瓜烘干粉水提物成分定性分析

籽瓜瓤活性成分鑒定見表2。

表2 籽瓜瓤活性成分鑒定Table 2 Identification of seed-watermelon pulp ingredients

由定性結(jié)果可知，籽瓜瓤烘干粉中的活性成分至少有6種，其中多糖還原糖和有機酸含量較多，是其主要成分；除此之外還含有少量的酚類及鞣質(zhì)、甾體及三萜、強心苷以及生物堿。由此表明籽瓜瓤成分較為豐富，水溶性物質(zhì)主要為糖類、有機酸，可能是其抑制酪氨酸酶活性的主要物質(zhì)。

2.3.2 籽瓜瓤中主要成分定量分析

籽瓜瓤中主要成分定量分析見表3。

表3 籽瓜瓤中糖類和有機酸定量分析Table 3 Quantitative analysis of saccharides and organic acids in seed-watermelon pulp

由定性分析可知，糖類和有機酸是籽瓜鮮瓤中的主要成分，故分別對其進(jìn)行定量分析；籽瓜鮮瓤中糖類檢測顯示，籽瓜鮮瓤中總糖為23.577 mg/g瓜瓤，包括葡萄糖、果糖兩種還原糖及多糖等糖類物質(zhì)。檢測籽瓜鮮瓤中有機酸表明，維生素C含有0.035 mg/g瓜瓤，蘋果酸含量最高為3.465 mg/g瓜瓤，檸檬酸為0.266 mg/g瓜瓤，籽瓜鮮瓤有機酸為3.766 mg/g瓜瓤，其中以蘋果酸為主。

2.4 籽瓜瓤糖類、有機酸及其混合配比對酪氨酸酶的抑制活性

2.4.1 籽瓜瓤糖類酪氨酸酶抑制活性

籽瓜瓤糖類對酪氨酸酶活性的抑制作用見圖3。

圖3 籽瓜瓤糖類對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp saccharides

經(jīng)檢測籽瓜鮮瓤中葡萄糖、果糖及粗多糖含量分別為11.0、12.0、0.577 mg/mL，以籽瓜90%含水量計，故烘干粉中的物質(zhì)含量均以鮮瓤的10倍計，如圖3中葡萄糖、果糖、粗多糖對酪氨酸酶抑制活性測定結(jié)果所示；籽瓜瓤粗多糖有一定的酪氨酸酶活性抑制作用，其濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL時，隨濃度增高抑制活性均在5%左右，同熊果苷的酪氨酸酶抑制活性具有顯著差異，說明籽瓜瓤粗多糖酪氨酸酶抑制活性不顯著；從圖3看出葡萄糖和果糖呈現(xiàn)一定的負(fù)值，表明葡萄糖、果糖具有微弱的促進(jìn)酶活作用，因此籽瓜瓤糖類可能不是抑制酶活的主要成分。

2.4.2 籽瓜瓤有機酸酪氨酸酶抑制活性

根據(jù)已測籽瓜鮮瓤有機酸的含量，對酪氨酸酶抑制活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 籽瓜瓤有機酸對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp organic acids

圖4表明籽瓜瓤中的維生素C、蘋果酸、檸檬酸及其復(fù)合有機酸（含量為3.8 mg/mL）均對酪氨酸酶抑制活性較弱；以烘干籽瓜瓤中有機酸濃度為38 mg/mL，按其濃度遞增，依次檢測其酶活抑制作用發(fā)現(xiàn)，有機酸隨濃度增加具有良好的酶活抑制效果，且抑制活性略高于熊果苷，同熊果苷已無顯著差異；因此籽瓜成分中的有機酸可能為抑制酶活的主要活性成分。為進(jìn)一步研究籽瓜瓤中糖類和有機酸與抑制酪氨酸酶活性的關(guān)系，故需對混合配比后的糖類有機酸抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行確定。

2.4.3 配比多糖有機酸酪氨酸酶抑制活性

根據(jù)籽瓜鮮瓤中多糖和有機酸的含量，以150 mg/mL濃度的烘干籽瓜粉水提物為參照，將其含量分別為1.0 mg/mL和5.7 mg/mL的多糖與有機酸進(jìn)行混合配比，測定其酪氨酸酶抑制活性結(jié)果見圖5。

圖5 籽瓜瓤多糖和有機酸對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.5 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp saccharides and organic acids

由圖5可發(fā)現(xiàn)多糖對酪氨酸酶抑制活性小于有機酸，兩者配比混合溶液抑制酪氨酸酶的活性均好于其對應(yīng)的單一溶液，說明籽瓜中的多糖和有機酸均具有一定的酪氨酸酶活抑制作用，有機酸效果好于多糖；兩者配比混合溶液同烘干籽瓜粉水提物及熊果苷溶液對酪氨酸酶活性抑制率相比具有顯著差異，進(jìn)一步說明籽瓜除有機酸是烘干籽瓜粉中酶活抑制的主要成分外，還應(yīng)存在其它酪氨酸酶活抑制成分；而150 mg/mL濃度的烘干籽瓜粉溶液同熊果苷溶液對酪氨酸酶活性抑制率類似，無顯著差異。因此說明烘干籽瓜粉水提物作為酪氨酸酶抑制物與熊果苷具有類似效果，其中的有機酸和多糖僅是籽瓜抑制酪氨酸酶活性的部分成分。

3 結(jié)論與討論

由于傳統(tǒng)藥食資源中含有的天然活性成分毒副作用小、安全性高，比化學(xué)合成的抑制劑具有更大優(yōu)勢，因此近年來逐漸成為酪氨酸酶抑制劑研究者的關(guān)注熱點。研究表明，天然植物中的活性成分多可作為酪氨酸酶抑制劑[25-27]?！侗静菥V目》記載“籽瓜性味甘”、“籽瓜而入心脾胃，內(nèi)有解心脾胃熱，止消溫”，自古以來就是一種具有較高營養(yǎng)和藥用價值的農(nóng)產(chǎn)品[28-29]。而且近幾年有學(xué)者對籽瓜中多糖、果膠、多酚以及皂苷等化合物進(jìn)行了提取及抗氧化、抗腫瘤、降血糖功效的研究[30-34]，表明籽瓜瓤中多糖和多酚類物質(zhì)具有一定的抗氧化活性，對屬于多酚氧化酶類的酪氨酸酶來說，其催化L-酪氨酸生成黑色素為一個氧化的過程[35]，因此多糖和酚類均具有潛在的抑制酪氨酸酶活作用。本文研究顯示籽瓜烘干粉水提物抑制酪氨酸酶活性最強，其主要成分為糖類和有機酸，進(jìn)一步定量分析后表明其中粗多糖具有酪氨酸酶活抑制作用，同已有研究結(jié)論相似，單糖對酪氨酸酶活性則具有促進(jìn)作用；而籽瓜瓤中的有機酸則表現(xiàn)出較強的酪氨酸酶活抑制作用，其中維生素C的抑制作用與已有研究[17-18]結(jié)果一致，蘋果酸和檸檬酸也有一定的酪氨酸酶活抑制作用；對籽瓜烘干粉水提物對應(yīng)混合配比研究后表明，籽瓜烘干粉水提物具有與熊果苷類似的酪氨酸酶活抑制效果，但其抑制率遠(yuǎn)好于其有機酸和多糖的混合配比溶液，表明其主要的抑制酪氨酸酶活的成分除籽瓜多糖、維生素C、蘋果酸和檸檬酸外，還應(yīng)含有其它成分；而籽瓜中含有的少量酚類及鞣質(zhì)、甾體及三萜、強心苷以及生物堿依然值得我們關(guān)注，這為深入籽瓜抑制酪氨酸酶活性成分探索提供了參考數(shù)據(jù)和方向。本研究表明籽瓜瓤作為一種潛在的酪氨酸酶活性抑制劑應(yīng)用于相關(guān)產(chǎn)業(yè)具有巨大潛力，且本處理方法簡單便捷，大規(guī)模應(yīng)用后即避免了籽瓜瓤對土地污染和資源浪費，又可提升其綜合利用率和經(jīng)濟價值。

目前，對于植物天然活性成分中篩選酪氨酸酶抑制劑的研究逐漸增多，其中黃酮和酚類物質(zhì)為多[15，35]，有機酸中的維生素C更是一種公認(rèn)的酪氨酸酶抑制劑[36]，且本研究也揭示了籽瓜中有機酸具有較好的酪氨酸酶抑制作用；但現(xiàn)有大部分研究只停留在某一類物質(zhì)的體外酪氨酸酶抑制活性探究，并未分離純化其確切是何種物質(zhì)，或進(jìn)行深入的作用機理研究。所以，對烘干籽瓜粉的酪氨酸酶抑制作用還需要進(jìn)一步研究其所有成分并深入探討抑制機制，才可能對籽瓜大規(guī)模的深加工提供全面的理論支撐。