赤霞珠葡萄酒生產(chǎn)廢棄物資源化利用*

毛建利李 艷

1（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）1（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

我國(guó)是世界上葡萄酒生產(chǎn)大國(guó)，年產(chǎn)量達(dá)到100多萬(wàn)千升，約剩余20萬(wàn)噸皮渣，其中分離葡萄籽6萬(wàn)噸、葡萄皮10萬(wàn)噸、葡萄梗4萬(wàn)噸，這些皮渣大多被用于生產(chǎn)飼料、肥料或者做填埋處理，利用率極低，不僅造成資源浪費(fèi)，也給生態(tài)環(huán)境造成了一定破壞。

Harman在20世紀(jì)50年代中期第一次提出了衰老自由基學(xué)說(shuō)，認(rèn)為衰老是細(xì)胞內(nèi)成分被氧自由基損害而造成的，維持體內(nèi)正常水平的自由基，可以延緩人體細(xì)胞的衰老。研究還發(fā)現(xiàn)，目前威脅著人體健康的癌癥、帕金森綜合征、糖尿病和艾滋病等多種重大疾病，都與生物大分子的氧化損傷有關(guān)。

單寧是一類水溶性多元酚化合物，分子量在500 Da～3 000 Da之間，性質(zhì)活潑，單寧的酚羥基與苯環(huán)直接相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有很好的抗氧化活性。單寧在葡萄梗中含量較多，縮合單寧中最有代表性的原花青素是所發(fā)現(xiàn)的有效的自由基清除劑之一,對(duì)多種疾病具有直接或間接的預(yù)防治療作用。本研究通過(guò)對(duì)葡萄梗中單寧的提取及抗氧化性研究，為今后這些資源的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

昌黎產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄釀酒廢棄物，包括葡萄皮、葡萄梗、葡萄籽；石家莊地區(qū)產(chǎn)巨峰葡萄釀酒廢棄物，包括葡萄皮、葡萄梗、葡萄籽。采用傳統(tǒng)工藝釀制葡萄酒后的皮渣，經(jīng)55℃烘干，磨粉，過(guò)40目篩，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；101-0AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；DELTA 320pH數(shù)字酸度計(jì)，梅普勒-托利多儀器有限公司；JJ1000電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；SHZ-HI真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單寧成分測(cè)定

單寧（以單寧酸計(jì)）：采用福林-丹尼斯法測(cè)定。

1.3.2 花色苷含量的測(cè)定

稱取1.5 g樣品溶于20 mL體積濃度60%的酸化乙醇溶液（鹽酸體積濃度為0.5%），50℃水浴3 h離心得到上清液。再加入15 mL酸化乙醇，50℃水浴3 h離心取上清液，重復(fù)第3次，合并3次上清液定容50mL備用，采用pH值示差法測(cè)定。

1.3.3 原料的選擇

分別稱取10 g不同樣品于250mL瓶中，加水50mL放入60℃水浴鍋中12 h，將清液濾至250mL容量瓶中；殘?jiān)尤?0mL熱水，80℃水浴20min，清液濾入容量瓶；殘?jiān)偌?0mL熱水，80℃水浴20min重復(fù)3～4次，直至提取液與10 g/L三氯化鐵溶液不生成藍(lán)色產(chǎn)物為止。定容至刻度，采用福林-丹尼斯方法測(cè)定提取液中單寧的含量，求出樣品中單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)即為樣品中單寧的提取得率。

1.3.4 提取劑的選擇

分別選取去離子水、體積濃度50%乙醇溶液，體積濃度50%丙酮溶液作為提取劑，葡萄皮渣粉按料液比為1 g∶25mL置于試劑瓶中密封，于60℃恒溫水浴中提取6 h，測(cè)定提取液中單寧提取得率。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

以料液比、提取溫度、提取時(shí)間和丙酮體積濃度為變化因素，以單寧提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。料液比分別為：1 g∶15mL、1 g∶20mL、1 g∶25mL、1g∶30mL、1g∶35mL；溫度為：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃；提取時(shí)間為：4 h、5 h、6 h、7 h、8 h；丙酮體積濃度設(shè)定為：30%、40%、50%、60%、70%。

1.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化單寧的提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化單寧的提取工藝。

1.3.7 抗氧化性能

1.3.7.1 ABTS自由基清除試驗(yàn)清除ABTS自由基能力測(cè)定采用分光光度法。

式中：A0——不加樣品時(shí)的吸光度；

A——加入不同量樣品時(shí)的吸光度。

樣品溶液：取1mL提取液，用提取溶劑稀釋成與Vc溶液同等濃度的溶液。

Vc溶液：用去離子水配制成質(zhì)量濃度為80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120 μg/mL、140 μg/mL、160μg/mL的溶液。

取4mL ABTS+·工作液，加入100μL樣品溶液，混勻反應(yīng)6min，黑暗環(huán)境下放置6min后于734 nm下測(cè)定吸光值，記為A。用提取劑替代樣品溶液的記為A0。

1.3.7.2 DPPH自由基清除試驗(yàn)

清除DPPH自由基能力的測(cè)定采用分光光度法。

式中：A空白——不加樣品時(shí)的吸光度；

A樣品——加入不同量的樣品時(shí)的吸光度。

樣品溶液：取1mL提取液，用提取溶劑稀釋成與Vc同等濃度的溶液。

Vc溶液：用去離子水配制質(zhì)量濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL的溶液。

分別吸取2mL的樣品溶液和Vc溶液于試管中，加入2mLDPPH溶液，每個(gè)樣品做3個(gè)平行對(duì)照，搖勻后避光，室溫放置30min，517 nm下測(cè)定吸光值，記為A樣品。用2mL提取溶劑代替樣品溶液，吸光值記為A空白。

1.3.7.3 鐵離子還原能力的測(cè)定鐵離子還原能力的測(cè)定采用分光光度法：

式中：A0—加入樣品和試劑時(shí)的吸光度；

A1—不加樣品時(shí)的吸光度。

樣品溶液：取1mL提取液，用提取溶劑稀釋成與Vc同等濃度的溶液。

Vc溶液：用去離子水配制質(zhì)量濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、140μg/mL的溶液。

吸取2.5mL磷酸鹽緩沖溶液、2.5mL鐵氰化鉀溶液以及不同質(zhì)量濃度的2.5mL樣品溶液，充分混勻。50℃水浴20min后快速冷卻，加2.5mL三氯乙酸混勻，3 000 r/min離心10min，取上清液2.5mL，加2.5mL體積分?jǐn)?shù)0.1%的氯化鐵溶液，反應(yīng)10min后在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（A0）。用同等體積的提取溶劑替代樣品溶液，測(cè)定吸光度A1。

1.3.7.4 羥自由基清除能力的測(cè)定

羥基清除能力的測(cè)定采用分光光度法：

式中：A1——加入樣品和羥基母體溶液時(shí)的吸光度；

A2——不加入羥基母體溶液時(shí)的吸光度；

A0——只加入羥基母體溶液時(shí)的吸光度。

樣品溶液：取1mL提取液，用去離子水稀釋成與Vc同等濃度的溶液。

Vc溶液：用去離子水配制質(zhì)量濃度為0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3mg/mL的溶液。

取3 mL的羥基母體溶液，分別加入1 mL不同濃度的樣品溶液，充分混勻，37℃恒溫水浴15min，用分光光度計(jì)在530 nm測(cè)定各組的吸光值A(chǔ)1（分光光度計(jì)校零時(shí)用去離子水），將羥基母體溶液用等量的提取溶劑代替，吸光值記為A2，將樣品溶液用等量的提取溶劑代替，吸光值記為A0。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003、Origin8.5、SPSS18.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的匯總與統(tǒng)計(jì)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒廢棄物單寧提取得率

研究了不同品種葡萄釀酒廢棄物各組織的單寧提取得率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄廢棄物中單寧的提取得率

由圖1可知，不同品種葡萄釀酒廢棄物的單寧提取得率差異顯著，且同一品種的葡萄釀酒廢棄物各組織之間的單寧提取得率也有顯著差異。其中赤霞珠葡萄梗的單寧提取得率達(dá)到了8.14%，巨峰梗的單寧提取得率達(dá)到了7.21%。

2.2 葡萄酒廢棄物中花色苷的提取得率

研究了不同品種葡萄釀酒廢棄物各組織的花色苷提取得率，結(jié)果見(jiàn)下頁(yè)圖2。

由圖2可知，不同品種葡萄釀酒廢棄物的花色苷提取得率差異顯著，同一品種不同組織部位的花色苷提取得率差異性不顯著。其中赤霞珠葡萄皮和赤霞珠葡萄籽的花色苷提取得率最高，均為0.10%。巨峰葡萄梗和皮的差異性呈現(xiàn)顯著性，其提取得率分別為0.022%和0.018%。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，后續(xù)試驗(yàn)選擇赤霞珠葡萄梗作為提取原料。

2.3 提取劑的選擇

選擇水、體積濃度50%乙醇溶液、體積濃度50%丙酮溶液為試劑，以葡萄梗為原料提取單寧，結(jié)果如圖3所示。

圖2 樣品花色苷的提取得率

圖3 不同提取劑對(duì)赤霞珠葡萄梗中單寧的提取得率

圖4 赤霞珠葡萄梗中單寧提取條件的單因素試驗(yàn)

由圖3可知，不同的提取劑對(duì)赤霞珠葡萄梗中單寧的提取得率差異顯著，其中體積濃度50%的丙酮對(duì)赤霞珠葡萄梗的單寧提取得率最高為7.75%。不同的溶劑極性不同，單寧的溶解率變化很大，水的提取得率最低為5.56%。因此選用提取得率較高的丙酮作為優(yōu)化提取赤霞珠葡萄梗的提取劑。

2.4 赤霞珠葡萄梗中單寧提取的單因素試驗(yàn)

分別進(jìn)行料液比、提取溫度、提取時(shí)間、丙酮體積濃度對(duì)單寧提取率的影響單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4看，在料液比1 g∶25mL附近，單寧的提取得率最高，為7.75%，繼續(xù)提高料液比，提取率沒(méi)有明顯增加。在浸提過(guò)程中，溫度會(huì)影響分子運(yùn)動(dòng)的速率，隨著溫度提高，可溶性物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加劇，單寧迅速滲出、溶解和擴(kuò)散至溶液中，60℃時(shí)單寧提取得率最高，到70℃時(shí)降低，溫度過(guò)高會(huì)破壞單寧或加速單寧的氧化分解。在恒定溫度下，提取時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)促使物質(zhì)溶出，因此呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，達(dá)到高峰值后下降，提取6 h時(shí)單寧的提取得率最高，時(shí)間再長(zhǎng)導(dǎo)致提取液中單寧成分在較高溫度下被破壞。丙酮體積濃度的改變，會(huì)影響到提取劑的極性，從而改變單寧的溶解度，單寧在體積分?jǐn)?shù)50%的丙酮溶劑中提取得率最高。

2.5 赤霞珠葡萄梗中單寧提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)正交設(shè)計(jì)對(duì)赤霞珠葡萄梗中單寧提取條件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)優(yōu)化葡萄梗中單寧的提取條件

由表2可知，各因素的極差大小順序?yàn)锳＞B＞C＞D，由此可得出，影響赤霞珠葡萄梗中單寧提取率的4個(gè)因素先后順序?yàn)椋毫弦罕龋緶囟龋緯r(shí)間＞丙酮體積濃度，最優(yōu)的提取工藝條件為：A2B2C2D2，即料液比1 g∶25mL，提取溫度60℃，提取時(shí)間6 h，丙酮體積濃度為50%。

在最優(yōu)正交試驗(yàn)條件下，進(jìn)行驗(yàn)證和擬合試驗(yàn)，試驗(yàn)平行3次求得平均值，單寧的平均提取得率為7.75%，比正交表中最佳提取得率提高6.71%。

2.6 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物體外抗氧化試驗(yàn)

2.6.1 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)ABTS自由基的清除試驗(yàn)

以Vc為對(duì)照，研究赤霞珠葡萄梗單寧提取液對(duì)ABTS自由基的清除率，對(duì)比效果見(jiàn)圖5。

圖5 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)ABTS自由基的清除試驗(yàn)

由圖5可知，單寧提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力明顯高于Vc。Vc質(zhì)量濃度在90μg/mL，對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到了50.92%，而單寧提取物在此濃度下對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到了90.01%。當(dāng)單寧提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到了110μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率就能達(dá)到100%。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，赤霞珠葡萄梗單寧提取物對(duì)ABTS自由基的清除效果明顯。

2.6.2 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)DPPH自由基的清除試驗(yàn)

以Vc為對(duì)照研究赤霞珠葡萄梗單寧提取液對(duì)DPPH自由基的清除率，對(duì)比效果見(jiàn)圖6。

圖6 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)DPPH自由基的清除試驗(yàn)

由圖6可知，赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力要明顯高于Vc。當(dāng)Vc的質(zhì)量濃度為30μg/mL，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到了48.30%，而同等濃度的單寧提取液對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到了97.00%。當(dāng)單寧質(zhì)量濃度增加到40μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率就能達(dá)到100%。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)DPPH自由基的清除效果明顯。

2.6.3 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)鐵離子的還原能力試驗(yàn)

以Vc為對(duì)照，研究赤霞珠葡萄梗中單寧提取液對(duì)鐵離子還原能力，對(duì)比效果見(jiàn)圖7。

圖7 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)鐵離子的清除試驗(yàn)

由圖7可知，赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)鐵離子的還原能力略低于Vc。當(dāng)Vc的質(zhì)量濃度為10μg/mL時(shí)，對(duì)鐵離子的清除率為55.46%，同等濃度下的單寧提取物對(duì)鐵離子的清除率為52.24%。隨著Vc和單寧提取物質(zhì)量濃度的增加，對(duì)鐵離子的還原能力也明顯增加。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)鐵離子的還原效果良好。

2.6.4 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)羥自由基的清除試驗(yàn)

以Vc為對(duì)照,研究赤霞珠葡萄梗中單寧提取液對(duì)羥自由基的清除率，對(duì)比效果見(jiàn)圖8。

由圖8可知赤霞珠葡萄梗中的單寧提取物對(duì)羥自由基的清除能力略弱于Vc。當(dāng)Vc質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到了54.44%，同等濃度下的單寧提取液對(duì)羥自由基的清除率也達(dá)到了50.12%。隨著Vc和單寧提取液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)羥自由基的清除率都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，赤霞珠葡萄梗對(duì)羥自由基的清除作用明顯。

3 結(jié)論

圖8 赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)羥自由基的清除試驗(yàn)

a）不同品種的葡萄釀酒廢棄物的單寧提取得率差異顯著，同一品種的葡萄釀酒廢棄物各組織之間的單寧提取得率差異也顯著。其中葡萄梗的單寧提取得率最高，赤霞珠葡萄梗的單寧提取得率為8.14%，巨峰葡萄梗的單寧提取得率為7.21%。

b） 在正交試驗(yàn)最優(yōu)條件下，即：料液比為1∶25（g/mL），提取溫度60℃，丙酮濃度為50%，浸提時(shí)間為6 h，進(jìn)行驗(yàn)證和擬合試驗(yàn)，試驗(yàn)平行3次求得平均值，單寧的平均提取得率為7.75%。

c）試驗(yàn)結(jié)果分析可知，以Vc為陽(yáng)性對(duì)照并對(duì)赤霞珠葡萄中的單寧提取液進(jìn)行ABTS、DPPH、羥自由基、鐵離子的清除試驗(yàn)，明顯看出赤霞珠葡萄梗中單寧提取物對(duì)4種自由基的清除效果良好，由此說(shuō)明赤霞珠葡萄梗具有開(kāi)發(fā)抗氧化產(chǎn)品的潛力。