miRNA-34a在胃癌細(xì)胞KATOⅢ中對(duì)5-Fu的增敏作用

劉 棣，張寅斌，宋玲琴，閆婉君，趙小瑤，盛倩文，許 朋，張淑群

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安 710004)

氟尿嘧啶是臨床最常用的胃癌化療藥物，通過干擾腫瘤細(xì)胞DNA合成而發(fā)揮抗癌作用。胃癌是常見的惡性腫瘤，在東亞國家發(fā)病率較高。胃癌的發(fā)生是多個(gè)癌基因、抑癌基因共同作用的結(jié)果。胃癌是預(yù)后較差的消化道腫瘤之一。胃癌治療失敗的主要原因是化療耐藥性的產(chǎn)生[1]。研究顯示，腫瘤細(xì)胞可抑制活化5-Fu所需的關(guān)鍵酶，增強(qiáng)5-Fu代謝酶的活性，降解胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)還原性葉酸底物，TS活性變化，這些機(jī)制都會(huì)產(chǎn)生對(duì)抗5-Fu的作用。隨著對(duì)微小RNA(microRNA，miRNA)認(rèn)識(shí)的不斷深入，近年來對(duì)胃癌化療耐藥性的研究轉(zhuǎn)向了miRNA。它是非編碼的單鏈小RNA，通常含有18～25個(gè)核苷酸序列[2]，miRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，作用于靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)參與生物學(xué)過程調(diào)控，在人類發(fā)育、腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c 3個(gè)成員組成，研究表明，miR-34a在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。筆者研究了miRNA-34a在胃癌腫瘤細(xì)胞中對(duì)5-Fu化療敏感性的影響，探討5-Fu在胃癌細(xì)胞中的耐藥機(jī)制。

1 資料與材料

1.1一般資料 選取2013年12月～2015年12月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院診斷為胃癌并接受手術(shù)治療的5例患者手術(shù)后標(biāo)本，男4例，女1例，平均年齡58歲。分別對(duì)胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行取材。

1.2材料與試劑 人胃癌細(xì)胞株SGC7901，GC823，MGC803，KATOⅢ 和MKN45人胃黏膜細(xì)胞GES-1(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。采用RPMI 1640和DMEM培養(yǎng)基采購培養(yǎng)細(xì)胞(Hyclone公司)；以miRNA mimics、miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞(Dharmacon公司，引物由北京華大基因公司合成)；RT-PCR相關(guān)試劑(TAKARA公司)；5-Fu(美國Sigma公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 選取人胃癌細(xì)胞BGC823、MGC803、SGC7901、KATOⅢ和MKN 45及人胃黏膜細(xì)胞株GES-1培養(yǎng)在含10%小牛血清的DMEM中。取細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(2.5×105·孔-1)。采用miR-34a mimic，negative control瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KATOⅢ細(xì)胞株。以無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌，加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2胃癌細(xì)胞組織RNA提取 將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板，加入Trizol裂解液，移液器混勻。組織置于液氮中，研磨成碎片，按照比例加入Trizol 100 mg和組織1 mL，轉(zhuǎn)入勻漿儀處理。加入氯仿，振蕩15 s。按protocol離心15 min，水相轉(zhuǎn)移到新管中，采用異丙嗪沉淀水相中的RNA，離心10 min，棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌RNA沉淀，真空抽干RNA沉淀，加入無Rnase水200 μL，60 ℃放置10 min，標(biāo)本于-80 ℃保存，備用。

2.3RT-PCR檢測(cè) 采用Trizol法處理提取RNA，標(biāo)本于-80 ℃保存，用紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度，波長為260～280 nm，吸光度值A(chǔ)為1.7～2.2。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，通過定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-34a表達(dá)量的變化。采用TaKaRa試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。產(chǎn)物于4 ℃保存，加入到下一步的real time PCR反應(yīng)。定量PCR采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行RT-PCR。95C預(yù)變性5 min，95C變性 10 s，60C退火 20 s，72C延伸 20 s，78C 20 s，共40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次，收集反應(yīng)數(shù)據(jù)。U6 snRNA作為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-34a的表達(dá)水平。

2.4四唑鹽比色法(MTT)檢查藥物濃度反應(yīng) 取對(duì)數(shù)期KATOⅢ細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(200 μL·孔-1)培養(yǎng)，每孔104個(gè)細(xì)胞，24 h后轉(zhuǎn)染。設(shè)置5-Fu濃度梯度：0，5，10，20，40和80 μmol·L-1等比稀釋后加入96孔板。在48 h后加入四唑鹽(MTT)10 μL，進(jìn)行MTT檢測(cè)，孵育4 h后，取上清液，加入DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)吸光度值。計(jì)算IC50值。

2.5四唑鹽比色法(MTT)檢查細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期KATOⅢ細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(200 μL·孔-1)培養(yǎng)24 h后，采用miR-34a mimic，negative control瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，分別于轉(zhuǎn)染后24，48和72 h對(duì)miR-34a mimic組和negative control組進(jìn)行MTT檢測(cè)。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。miR-34a的表達(dá)量、增殖率的比較采用t檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1胃癌細(xì)胞株中miR-34a的表達(dá) 定量PCR檢測(cè)各胃癌細(xì)胞株miR-34a表達(dá)水平，以胃黏膜細(xì)胞GES-1為參照，miR-34a相對(duì)表達(dá)量為1，對(duì)各胃癌細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞BGC823、KATOⅢ、MGC803、MKN45和SGC7901中miR-34a的表達(dá)均低于胃黏膜細(xì)胞GES-1的表達(dá)水平(P<0.05)，分別為0.223 75±0.015，0.248±0.025，0.34±0.041，0.302±0.035和0.386±0.032。

3.2胃癌組織中miR-34a的表達(dá) 通過定量PCR檢測(cè)各胃癌組織及鄰近正常組織miR-34a表達(dá)水平，對(duì)比胃癌組織中miR-34a的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-34a的表達(dá)均低于鄰近胃正常組織的表達(dá)水平(P<0.05)，見表1。

表1胃癌組織中miR-34a的表達(dá)情況

Tab.1 The expression of miR-34a in gastric cancer tissue

患者編號(hào)正常組織(N)腫瘤組織(T)PT10.938 7±0.0120.343±0.042*PT21.145±0.1050.352±0.048*PT30.855±0.030.545 5±0.035*PT41.103 5±0.0650.648±0.049*PT50.751±0.0610.628±0.052 6*

注：與正常組織(N)比較*P<0.05。

3.3miR-34a增加腫瘤細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性 本研究選取的胃癌細(xì)胞BGC823、KATOⅢ、MGC803、MKN45和SGC7901中miR-34a均處于低表達(dá)狀態(tài)，選取惡性程度較高的KATOⅢ進(jìn)一步研究miR-34a對(duì)5-Fu敏感性的影響。在KATOⅢ 細(xì)胞中，上調(diào)miR-34a表達(dá)后按濃度梯度加入化療藥物5-Fu。藥物作用48 h后，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值A(chǔ)，藥物濃度反應(yīng)曲線顯示，與negative control(NC)組比較，miR-34a mimics組IC50值下降(P<0.05)。上調(diào)miR-34a后，KATOⅢ 細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性增加。見圖1。

圖1miR-34a對(duì)KATOⅢ細(xì)胞5-Fu(mol·L-1)敏感性的影響(*P<0.05)

Fig.1 The influence of miR-34a on sensitivity of 5-Fu (mol·L-1) in KATOⅢ cells (*P<0.05)

3.4miR-34a抑制KATOⅢ細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，miR-34a mimics組與control組相比較，miR-34a組對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)，見圖2。

圖2miR-34a對(duì)細(xì)胞增殖的影響(*P<0.05)

Fig.2 The influence of miR-34a onKATOⅢ cell proliferation (*P<0.05)

4 討論

胃癌對(duì)5-Fu的耐藥性一直備受關(guān)注，腫瘤的耐藥機(jī)制較復(fù)雜，涉及多個(gè)基因和過程，是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果[4]。研究顯示，耐藥相關(guān)基因異常表達(dá)，會(huì)使抗腫瘤藥物濃度下降，影響藥物的療效[5-7]。近年來，有研究顯示，miRNAs也通過多種途徑直接或間接地參與調(diào)控腫瘤的耐藥性和敏感性[8-14]。通過miRNAs來影響腫瘤對(duì)藥物的敏感性成為可能[15-18]。

研究表明，一些miRNAs可能增加腫瘤化療的耐藥性[19]。一項(xiàng)入組1 299例乳腺癌相關(guān)miRNA研究中發(fā)現(xiàn)，miR-105和miR-93-3p在乳腺癌中處于高表達(dá)狀態(tài)，且與三陰性乳腺癌較差的預(yù)后密切相關(guān)，其機(jī)制可能是miR-105和miR-93-3p通過下調(diào)SFPR1，從而激活癌細(xì)胞Wnt/β-catenin通路活性，促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞性，增加化療耐藥性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[20]。相反，有一些miRNAs被認(rèn)為可以增加腫瘤化療敏感性。胰腺癌常對(duì)化療藥物耐藥，研究表明，miR-429在吉西他濱耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ中低表達(dá)，而上調(diào)miR-429的表達(dá)后，PDCD4的表達(dá)也上調(diào)，而SW1990/GZ細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，體外的PDCD4敲除實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)研究表明，miR-429通過調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中的PDCD4，來增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性[21]。Kim C H等[1]在胃癌中做了耐藥性相關(guān)miRNAs的研究，發(fā)現(xiàn)上調(diào)let-7、miR-342和miR-16等的表達(dá)，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡，增加化療敏感性。而一些與鉑類、氟尿嘧啶耐藥相關(guān)的miRNAs與疾病進(jìn)展時(shí)間密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a無論是在胃癌細(xì)胞還是在胃癌組織中都處于低表達(dá)狀態(tài)。其中在胃癌細(xì)胞KATOⅢ中同樣處于較低表達(dá)狀態(tài)，依此推斷miR-34a在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。在分化較差的KATOⅢ細(xì)胞中上調(diào)了miR-34a的表達(dá)，檢測(cè)胃癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加。KATOⅢ細(xì)胞株被認(rèn)為是P53突變、表達(dá)缺失的細(xì)胞株，上調(diào)miR-34a的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖被抑制，提示這可能恢復(fù)了P53的功能，腫瘤細(xì)胞因此表現(xiàn)為對(duì)化療藥物更為敏感。依此推測(cè)miR-34a在胃癌細(xì)胞中的這種調(diào)控機(jī)制可能與其下游的Notch和Bcl-2等基因相關(guān)，它可能參與了胃癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化，這一推測(cè)還有待后續(xù)的研究進(jìn)一步證實(shí)。

藥物耐藥性和敏感性一直都是研究中的難點(diǎn)問題[22-26]。5-Fu作為消化道腫瘤基礎(chǔ)的化療藥物，在臨床中廣泛應(yīng)用，本研究以miRNAs為著眼點(diǎn)，探索研究了5-Fu在胃癌治療中敏感性的可能機(jī)制，結(jié)果表明，5-Fu的化療敏感性受miR-34a的調(diào)控，被認(rèn)為是其調(diào)控機(jī)制之一，可能在胃癌的化療中發(fā)揮重要作用，為今后的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。