多次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療失代償期乙型肝炎肝硬化患者臨床研究

張駿飛，宋海燕，陳曦，潘勁勁，劉力偉，陳從新，劉波

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力，在特定微環(huán)境中可分化成肝干細(xì)胞或肝樣細(xì)胞，修復(fù)和重構(gòu)受損的肝臟結(jié)構(gòu)和功能，已成為近年來肝病治療領(lǐng)域的新方法[1-4]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs） 與骨髓MSCs比，有著來源豐富、取材方便、分化潛能大、增殖能力更強(qiáng)、免疫原性弱等顯著優(yōu)點[5，6]。研究表明，HUC-MSCs有促進(jìn)肝臟再生、改善肝硬化患者肝功能的作用[6，7]。但一次細(xì)胞移植能否獲得好的療效？多次移植是否會增加癌化風(fēng)險和減少其它并發(fā)癥的發(fā)生等問題，尚缺乏臨床對照研究。本研究通過分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增HUC-MSCs單次移植與多次移植治療肝硬化患者，探討了其對乙型肝炎肝硬化患者臨床癥狀和肝功能的影響，評價了其療效和安全性。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 2012年1月～2015年1月我科診治的乙型肝炎肝硬化患者60例，男性82例，女性16例；年齡 26～7l歲，平均年齡為（45.3±4.3）歲。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除乙型肝炎以外原因引起的肝硬化、或合并惡性腫瘤、吸毒或飲酒、近半年內(nèi)服用過損肝藥物或存在心、肺、腎等臟器功能衰竭者。本研究在中國臨床試驗注冊中心注冊（ChiCTR-ONC-12002936），且已經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 HUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和表型鑒定[6，9]自我院產(chǎn)科獲得足月妊娠健康胎兒胎盤（孕婦簽署知情同意書），排除人類免疫缺陷病毒、梅毒螺旋體、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染者。胰蛋白酶、膠原酶、膠原蛋白和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，抗-CD29PE、抗 CD34FITC、抗 CD44PE 和 抗 CD45-FITC購自貝克曼公司。采用貼壁法分離HUC-MSCs。取培養(yǎng)至第3代的HUC-MSCs（圖1），制成1×106/ml細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況，結(jié)果細(xì)胞 CD44陽性率為99.2%，CD34為陰性，CD29陽性率為99.8%，CD45為陰性。同時，取培養(yǎng)基上清行細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)及檢測支原體感染標(biāo)志物和內(nèi)毒素。間充質(zhì)干細(xì)胞純度達(dá)99%，經(jīng)臺盼藍(lán)活細(xì)胞染色鑒定，細(xì)胞存活率為99%。經(jīng)各項檢測合格后，制備成間充質(zhì)干細(xì)胞懸液20 ml，含HUC-MSCs約4×108個。

1.3 治療方法 將患者分為對照組、單次組和多次細(xì)胞移植組。在對照組，采用護(hù)肝、退黃、抗病毒等對癥支持治療，必要時給予利尿、輸注人血白蛋白。對有消化道出血者，予以止血、輸血，給予肝性腦病者門冬氨酸鳥氨酸和支鏈氨基酸處理；在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，給予部分患者HUC-MSCs肝內(nèi)移植治療1次，而另一些患者則接受2次或3次HUC-MSCs移植治療（每次間隔>12個月），隨訪三組患者36個月。細(xì)胞移植方法：依據(jù)病情，在DSA引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺股動脈，插管至肝固有動脈，注射造影劑，將制備好的HUC-MSCs懸液20 ml緩慢注入肝動脈左右分支，各10 ml。術(shù)畢、拔管，穿刺點加壓包扎24 h，穿刺側(cè)下肢制動24 h，行介入后常規(guī)護(hù)理。在凝血酶原時間不延長的患者，采用經(jīng)超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮肝內(nèi)門靜脈穿刺，將HUC-MSCs緩慢注入門靜脈左右分支，各10 ml，術(shù)后敷料覆蓋穿刺點，回病房臥床休息8 h，行肝穿刺后常規(guī)護(hù)理。隨訪期間，常規(guī)行超聲檢查，評估肝脾大小情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析或成對資料的t檢驗，計數(shù)資料的比較采用x2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 干細(xì)胞培養(yǎng) 鏡下見漩渦狀生長的梭形P3人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

2 結(jié)果

2.1 一般情況 兩組接受細(xì)胞移植患者均順利完成手術(shù)。在隨訪期間，在20例單次移植組，死亡3例（15%），其中2例在移植后36周和71周死于慢性肝衰竭，1例在136周時死于上消化道出血；在20例接受多次細(xì)胞移植患者，死亡2例（10%），其中1例在移植后第25周時死于慢性肝衰竭，1例在40周時死于上消化道出血；在20例對照組中，死亡5例（25%），其中2例在隨訪第12周和141周死于肝性腦病，2例在第60周和第86周時，死于慢性肝衰竭，1例在第120周死于上消化道出血。三組病死率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 三組肝功能指標(biāo)變化的比較 治療前，三組血清TBIL、ALB、INR和Child-Pugh評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在隨訪12個月和24個月時，單次移植組血清ALB水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在隨訪36個月結(jié)束時，多次移植組血清TBIL、ALB、INR和Child-Pugh評分與單次移植組和對照組比，均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，表1）。

2.3 各組肝、脾臟大小比較 入組前，三組患者肝臟最大平掃面積、脾臟長度和厚度比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；在隨訪36月結(jié)束時，多次接受細(xì)胞移植患者肝臟最大平掃面積較對照組顯著增大、脾臟長度和厚度較對照組顯著縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.4 三組并發(fā)癥發(fā)生率比較 三組并發(fā)癥發(fā)生率比較，見表3。

表1 三組肝功能指標(biāo)（±s）比較

表1 三組肝功能指標(biāo)（±s）比較

與對照組比，①P<0.05；與單次移植組比，②P<0.05

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表2 三組肝臟和脾臟大?。ā纒）比較

表2 三組肝臟和脾臟大?。ā纒）比較

與對照組比，①P<0.05

例數(shù) 肝臟面積（cm2） 脾臟長度（mm） 脾臟厚度（mm）對照組 治療前 20 140.9±16.3 150.6±23.5 48.1±9.9治療后 15 134.3±15.6 154.7±20.1 49.9±8.7單次移植 治療前 20 139.9±17.6 149.4±24.5 48.2±9.36治療后 17 139.6±12.4 148.5±24.1 47.6±10.8多次移植 治療前 20 138.2±17.8 151.4±20.5 48.2±9.3治療后 18 140.2±14.5① 145.2±19.3① 45.8±9.2①

表3 三組并發(fā)癥發(fā)生率（%）比較

3 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HUC-MSCs可通過抑制淋巴細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子的分泌，減少肝硬化患者發(fā)生肝衰竭的概率[10-12]。多數(shù)研究提示干細(xì)胞移植治療肝硬化患者可改善肝功能，且無嚴(yán)重的并發(fā)癥[13]。

本研究進(jìn)一步分析比較了單次和多次HUC-MSCs移植治療失代償期乙型肝炎肝硬化患者，結(jié)果顯示在隨訪12個月時，多次移植組肝功能改善程度顯著優(yōu)于單次移植組。在隨訪24個月和36個月時，接受多次HUC-MSCs移植患者肝功能指標(biāo)進(jìn)一步改善，提示一次細(xì)胞移植不能鞏固療效，而往往需要多次行細(xì)胞移植治療。在肝內(nèi)移植后，HUC-MSCs可直接到達(dá)受損的肝損傷部位，一方面可分化成新的肝臟功能細(xì)胞，或還能“催醒”自身肝臟細(xì)胞；另一方面通過HUC-MSCs分泌的各種細(xì)胞因子，修復(fù)和營養(yǎng)受損的肝細(xì)胞[14，15]。但是，隨著時間的推移，這種功能降低，肝功能可能繼續(xù)惡化。故多次給予干細(xì)胞移植，不斷修復(fù)繼續(xù)受損的肝細(xì)胞，得以使肝功能穩(wěn)定。

國內(nèi)有學(xué)者[16，17]研究表明干細(xì)胞移植后肝臟最大橫截面積增大，脾臟體積縮小。我們認(rèn)為，細(xì)胞移植入肝內(nèi)后，干細(xì)胞可能轉(zhuǎn)化為肝樣細(xì)胞，增加肝細(xì)胞數(shù)量。

許多學(xué)者研究證實，干細(xì)胞移植治療肝硬化療效肯定，操作安全[18-19]。在細(xì)胞移植術(shù)后少數(shù)患者出現(xiàn)發(fā)熱，多為低熱，經(jīng)對癥處理后，體溫恢復(fù)正常，未影響繼續(xù)治療。三組患者均有肝癌和肝衰竭發(fā)生，但發(fā)生率比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明三組患者原發(fā)性肝癌和肝衰竭的發(fā)生與HUC-MSCs移植無顯著相關(guān)，為與其疾病的演變過程有關(guān)。我們認(rèn)為，HUC-MSCs肝內(nèi)移植不會增加發(fā)生腫瘤的風(fēng)險。接受多次細(xì)胞移植患者腹水發(fā)生率低，血清白蛋白上升，肝功能指標(biāo)穩(wěn)定。

本研究觀察了細(xì)胞移植前后肝脾大小的變化，但由于只是經(jīng)超聲檢查獲得的數(shù)據(jù)，結(jié)果的可信度還需要證實。下一步將采用CT掃描，計算肝脾體積的方法，使細(xì)胞移植前后結(jié)果更具可比性。