慢性丙型肝炎和肝硬化患者外周血Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子水平變化*

周思思，沈有秀，李娟，俞科賢

據(jù)報(bào)道，70%～80%HCV感染會(huì)發(fā)展為慢性肝病，其中約20%可進(jìn)展為肝硬化（liver cirrhosis，LC），甚至肝癌[1]。輔助性T淋巴細(xì)胞17（ helper T lymphocytes 17，Th17） 和調(diào)節(jié)性 T淋巴細(xì)胞（regulatory T lymphocytes，Treg）是新型 T 淋巴細(xì)胞亞群，具有促炎和抗炎的雙重能力[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg細(xì)胞比值失衡和細(xì)胞分子水平異常可促使肝炎病毒感染向慢性化發(fā)展，加重肝組織免疫炎癥反應(yīng)[3]。本研究檢測(cè)了慢性丙型肝炎（CHC）和丙型肝炎肝硬化患者外周血Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子水平，以探討它們變化的臨床意義，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年10月～2016年10月本院收治的CHC患者33例，男17例，女16例；年齡16～50歲，平均年齡（36.35±4.28）歲。丙型肝炎肝硬化患者27例，男13例，女14例；年齡26～61歲，平均年齡（46.82±6.32）歲。符合慢性丙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，經(jīng)影像學(xué)檢查診斷LC，Child-Pugh評(píng)分≥7分。排除乙型肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝病、惡性腫瘤、精神病史和合并HIV感染患者。另選同期在本院健康體檢者30例作為對(duì)照組，男16例，女14例；年齡17～63歲，平均年齡（45.91±6.23）歲。受試者簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 對(duì)CHC患者，給予α-干擾素聯(lián)合利巴韋林（PR）治療方案，即給予聚乙二醇干擾素α-2a（派羅欣，上海羅氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20120075）180 μg皮下注射，1 次 /w，利巴韋林（江西匯仁藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20033538）300 mg口服，3次/d。治療12 m，根據(jù)《丙型肝炎防治指南》（2004版）的藥物應(yīng)用指導(dǎo)原則調(diào)整劑量和治療療程。

1.3 外周血Th17和Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子水平檢測(cè) 清晨，采集空腹靜脈血10 mL，采用ELISA法檢測(cè)白介素 -6（interleukin-6，IL-6）、IL-10、IL-17和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β，美國(guó)Market公司）；使用美國(guó)Beckman公司提供的流式細(xì)胞儀及其檢測(cè)Th17和CD4+CD25+Foxp3+Treg一步法試劑盒檢測(cè)血Th17和Treg細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩均數(shù)的比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用x2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血Th17和Treg細(xì)胞數(shù)比較 LC和CHC患者外周血Th17和Treg細(xì)胞比率和Th17/Treg比值顯著高于健康人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LC患者外周血Th17和Treg細(xì)胞比率和Th17/Treg比值顯著高于CHC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

表1 三組外周血Th17和Treg細(xì)胞（±s）比較

表1 三組外周血Th17和Treg細(xì)胞（±s）比較

與健康人比，①P<0.05；與CHC患者比，②P<0.05

例數(shù) Th17細(xì)胞（%） Treg細(xì)胞（%） Th17/Treg比值健康人 30 2.3±0.4 1.7±0.4 1.4±0.2 CHC 33 4.6±0.7① 2.7±0.5① 1.6±0.4①LC 27 5.8±0.9①② 3.1±0.6①② 1.9±0.5①②

2.2 三組血清細(xì)胞因子水平比較 LC和CHC患者血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平均顯著高于健康人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LC患者血清IL-6、IL-10、IL-17和 TGF-β 水平顯著高于 CHC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表2）。

表2 三組血清細(xì)胞因子水平（ng/L，±s）比較

表2 三組血清細(xì)胞因子水平（ng/L，±s）比較

與健康人比，①P<0.05；與CHC患者比，②P<0.05

例數(shù) IL-6 IL-10 IL-17 TGF-β健康人 30 6.7±1.1 14.2±2.9 5.3±0.6 4.3±1.0 CHC 33 9.9±2.5① 18.0±3.2① 15.3±2.8① 5.5±0.8①LC 27 14.1±3.0①② 21.4±4.0①② 23.3±3.9①② 7.2±1.2①②

2.3 CHC患者治療前后外周血Th17和Treg細(xì)胞比率及血清細(xì)胞因子水平變化的比較 治療后，CHC患者外周血Th17和Treg細(xì)胞比率及血清TGF-β、IL-10和IL-17水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表3）。

表3 CHC患者外周血Th17和Treg細(xì)胞比率及血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

表3 CHC患者外周血Th17和Treg細(xì)胞比率及血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

例數(shù) Th17細(xì)胞（%） Treg細(xì)胞（%） TGF-β（ng/L） IL-10（ng/L） IL-17（ng/L）治療前 33 4.6±0.7 2.7±0.5 5.5±0.8 18.0±3.2 15.3±2.8治療后 33 3.4±0.6 1.9±0.4 4.7±0.6 15.1±2.5 11.5±2.1 t值 - 7.477 7.177 4.596 4.102 6.237 P值 - <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

目前，Th細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子失衡被認(rèn)為是肝炎病毒感染的主要致病機(jī)制，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞失衡方面[5，6]。另有資料顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生影響Th17和Treg細(xì)胞分化的細(xì)胞因子[7]。Th17是新近發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，可分泌IL-17、IL-6、IL-22等細(xì)胞因子，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在自身免疫疾病和機(jī)體防御方面意義重大。而Treg作為新型T細(xì)胞亞群，可分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受，控制自身免疫反應(yīng)[8，9]。研究表明，Th17和Treg細(xì)胞均可能參與了肝炎病毒感染的進(jìn)程，并起到重要的作用[10]。

在HCV感染后，機(jī)體肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生并大量釋放胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素，進(jìn)而刺激Th17細(xì)胞增值和分化，而Th17細(xì)胞可分泌IL-17并對(duì)肝細(xì)胞凋亡形成抑制，促使HCV感染細(xì)胞存活，從而造成HCV感染慢性化發(fā)展[11-13]。此外，Treg細(xì)胞增多可有助于HCV清除，抑制肝纖維化進(jìn)展[14]，但它還可協(xié)同多種細(xì)胞因子如TGF-β和IL-10等作用，誘導(dǎo)HCV感染慢性化[15]。研究表明，CHC患者外周血Th17/Treg細(xì)胞比例較健康人高，在抗病毒治療后Th17/Treg比例則顯著降低，推測(cè)Th17/Treg細(xì)胞比值在感染慢性化進(jìn)程中可能出現(xiàn)了動(dòng)態(tài)變化[16]。本研究顯示，CHC組和LC組外周血Th17、Treg細(xì)胞比率和Th17/Treg比值均顯著較對(duì)照組高，LC組顯著高于CHC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有關(guān)研究結(jié)果[17]相似，提示Th17和Treg細(xì)胞在CHC發(fā)生發(fā)展過程中增加明顯，造成Th17/Treg細(xì)胞平衡紊亂，進(jìn)而加速CHC病情的進(jìn)展。在相關(guān)細(xì)胞因子方面，研究表明，IL-17、TGF-β和IL-10水平升高可能是產(chǎn)生肝硬化的重要因素[18]。IL-17可對(duì)肝星狀細(xì)胞形成起促進(jìn)作用，在TGF-β的直接作用下，加快肝星狀細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成速度，引起肝纖維化，而IL-10雖可抑制炎癥反應(yīng)，但可促使TGF-β合成，進(jìn)而加重肝纖維化。另有研究表明，血清IL-6水平與肝纖維化關(guān)系密切，相關(guān)分析顯示IL-6水平與肝炎嚴(yán)重程度存在正相關(guān)關(guān)系[19]，說明細(xì)胞因子水平對(duì)病毒感染的進(jìn)展起作用。有資料顯示，IL-17、TGF-β和IL-10等細(xì)胞因子水平升高可加速Treg細(xì)胞分化，促使丙型肝炎病毒向慢性丙型肝炎發(fā)展[20]。健康人血清細(xì)胞因子水平最低，而CHC組和LC組則升高，且Th17、Treg細(xì)胞比率和各細(xì)胞因子水平與肝功能指標(biāo)存在正相關(guān)關(guān)系[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，LC組和CHC組血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平均顯著高于對(duì)照組，LC組血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平又顯著高于CHC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Th17、Treg細(xì)胞和血清細(xì)胞因子水平與CHC或LC發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系。Th17細(xì)胞可分泌IL-17，可直接作用于肝星狀細(xì)胞表面的IL-17R，進(jìn)而激活肝星狀細(xì)胞，分泌更多IL-6，并促使 TGF-β、TGF-α 水平升高[22]，而 Treg細(xì)胞分泌的IL-10可形成對(duì)中性粒細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)，降低對(duì)肝細(xì)胞的損害，但可抑制HCV特異性T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌，其與Th17細(xì)胞的分化作用相互排斥[23-25]。故當(dāng)Th17/Treg比值升高，Th17細(xì)胞比率高于Treg細(xì)胞時(shí)，可反映HCV感染的慢性化進(jìn)展。此外，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，病毒性肝炎患者經(jīng)抗病毒治療后Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和血清IL-17、TGF-β、IL-10和IL-23水平均比治療前顯著降低[26]。本研究數(shù)據(jù)顯示，CHC患者經(jīng)抗病毒治療后外周血Th17、Treg細(xì)胞比率和血清TGF-β、IL-10和IL-17水平均顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說明外周血Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子水平可反映CHC患者病情變化，或許對(duì)新治療靶點(diǎn)的探尋以及治療效果的判斷具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

本研究病例數(shù)較少，觀察時(shí)間較短，且為單中心觀察，未對(duì)接受抗病毒治療的CHC患者進(jìn)行不同應(yīng)答分層比較，故還有待于進(jìn)一步大樣本的隨訪觀察。