欖香烯對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株生物學(xué)作用機(jī)制

關(guān)永紅,唐 艷,董全宇,劉賢英

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春130041)

卵巢癌為三大婦科惡性腫瘤之一。具有發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，轉(zhuǎn)移及侵襲能力強(qiáng)，惡性度高的特點(diǎn)[1]。早期診斷率低，大部分患者確診時(shí)已是晚期。失去了手術(shù)治療的可行性，只能通過輔助治療延長其生存期。近年來隨著腫瘤細(xì)胞學(xué)的發(fā)展和大量靶向藥物的臨床應(yīng)用。從細(xì)胞學(xué)水平預(yù)測(cè)治療方式的有效性和藥物敏感性不僅成為可能，而且成為必然趨勢(shì)[2]因此本研究依SKOV3細(xì)胞為靶點(diǎn)，探討其對(duì)欖香烯制劑的生物學(xué)機(jī)制，為卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料、細(xì)胞，藥物及試劑

卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；欖香烯注射液由大連金港制藥有限公司生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)板，RPMI1640培養(yǎng)基，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購于美國sigma公司，胎牛血清購于長春生物制品研究所)

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后置于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基內(nèi)于37°C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104/ml，加入96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔100 μl/孔分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(欖香烯濃度為100,200,400 μg/ml)

1.2.2細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)(MTT試驗(yàn)) 取96孔培養(yǎng)板內(nèi)生長良好SKOV3細(xì)胞分組，空白對(duì)照組，只加入100 μl細(xì)胞維持液，共10復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組分別加入由細(xì)胞維持液配制的不同濃度的欖香烯溶液，每個(gè)濃度10復(fù)孔，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，結(jié)束前4小時(shí)每孔內(nèi)分別加入MTT試劑20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔內(nèi)分別加入二甲基亞砜(DMSO)200 μl震蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度A值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)]×100%，結(jié)果見表1。

表1 不同濃度欖香烯制劑對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖抑制率

1.2.3SKOV3細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.2，不同之處是將96孔培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行。每個(gè)濃度5瓶培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，PBS(磷酸鹽緩沖液)洗3次。70%乙醇固定，置4℃冰箱內(nèi)48 h后取出離心1 000 r/5 min，碘化丙啶漂色，避光孵育30 min，然后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用CELL QUEST軟件分析各組細(xì)胞周期各時(shí)相變化及凋亡率，結(jié)果見表2。

1.2.4透射電子顯微鏡觀察 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別收集經(jīng)不同濃度欖香烯制劑作用后的SKOV3細(xì)胞懸液于錐型離心管內(nèi)離心沉淀1 000 r/10 min，棄去上清，細(xì)胞沉淀物經(jīng)2.5%戌二醛前固定。1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛一鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1MTT結(jié)果不同濃度的欖香烯制劑對(duì) SKOV3細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。

2.2流式細(xì)胞儀結(jié)果不同濃度的欖香烯制劑作用于SKOV3細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M細(xì)胞相對(duì)增多，細(xì)胞凋亡率升高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示欖香烯制劑能夠阻滯SKOV3細(xì)胞周期進(jìn)程改變，及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率增高。

表2 不同濃度欖香烯制劑對(duì)SKOV3細(xì)胞周期進(jìn)程改變及凋亡率

2.3透射電子顯微鏡結(jié)果不同濃度欖香烯制劑作用SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞膜破裂，線粒體腫脹，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，可見凋亡小體改變，微管，微絲斷裂，胞漿內(nèi)有空泡形成，見圖1-3。

圖1 100μg/ml欖香烯對(duì)SKOV3細(xì)胞 改變，線粒體腫脹，有空泡形成5000×圖2 200 μg/ml欖香烯對(duì)SKOV3細(xì)胞改變，細(xì)胞膜破裂，核染體凝集5000×圖3 400 μg/ml欖香烯對(duì)SKOV3細(xì)胞改變，細(xì)胞核破碎，可見凋亡小體5000×

3 討論

卵巢癌早期診斷困難單純手術(shù)切除治愈率較低，目前采取手術(shù)為主.放療化療為輔的綜合治療。然而.由于傳統(tǒng)的化療藥物存在不同程度的不良反應(yīng).在損傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常器官和組織也有明顯的損傷。因此、尋找不良反應(yīng)小或無不良反應(yīng)的藥物成為目前卵巢癌治療的新熱點(diǎn)。欖香烯是從草本植物中藥莪術(shù)中提取的一種揮發(fā)油類物質(zhì)[3]，研究證明該物質(zhì)具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂.抗突變等多種生物學(xué)作用.而且毒副作用小，獲取方便，廣泛用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、婦科系統(tǒng)腫瘤的治療、尤其是腫瘤所致的胸腔、腹腔積液.治療效果顯著。因此，本研究應(yīng)用欖香烯制劑，體外觀察對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖抑制作用及細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞凋亡及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。MTT.結(jié)果表明，不同濃度的欖香烯制劑對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用均獲得了較為滿意結(jié)果，抑制率分別為16.2% 37.8%和45.6.%與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.01。MTT 試劑可被哺乳動(dòng)物活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶吸收，將MTT試劑還原成藍(lán)色甲臜顆粒。且甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系。因此MTT試驗(yàn)被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究。具有一定的客觀性。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度的欖香烯制劑對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖周期各時(shí)相均有不同程度的抑制作用，細(xì)胞周期是一個(gè)高度保守備受各種細(xì)胞因子嚴(yán)格控制[4].任何一個(gè)環(huán)節(jié)失控即可發(fā)生功能和形態(tài)學(xué)改變，欖香烯誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞具有一定的濃度依賴性、均表現(xiàn)出G0/G1期細(xì)胞增多。S期細(xì)胞減少。從而使G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng)，這一現(xiàn)象從細(xì)胞凋亡率得到了證實(shí)。凋亡率分別為9.6%，16.9%和19.2%。文獻(xiàn)報(bào)道[5]。在腫瘤治療中，細(xì)胞周期阻滯對(duì)于減緩腫瘤的生長.提高治療的效率尤為重要。由于腫瘤細(xì)胞多發(fā)生P53基因突變從而缺泛G1期檢查點(diǎn)、而G1期檢查點(diǎn)是各種化學(xué)藥物作用的敏感點(diǎn)。欖香烯制劑恰巧使skov3細(xì)胞G1期檢查點(diǎn)阻滯.從而使腫瘤細(xì)胞增長變緩。不能進(jìn)入S期。G2/M期作為細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂之前的最后一道關(guān)卡、多種治療手段都會(huì)使腫瘤細(xì)胞具有選擇性停止該期[6]且有作為新型腫瘤治療靶點(diǎn)的可能性。

此外.本研究還應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察經(jīng)不同濃度的欖香烯制劑作用后的SKOV3細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變.細(xì)胞器線粒體腫脹，有空泡形成.核染色質(zhì)趨邊凝集.紡錘體斷裂.可見凋亡小體改變。

綜上所述.欖香烯誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞具有一定的濃度依賴性、因此、研究細(xì)胞周期阻滯機(jī)制不僅對(duì)基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)有重要的理論價(jià)值，也對(duì)預(yù)防和治療腫瘤有重要的指導(dǎo)意義。為了提高欖香烯的抗癌效果，同時(shí)減輕不良反應(yīng)，探索新的藥物劑型、在降低毒性的基礎(chǔ)上，通過增加劑量、延長作用時(shí)間，以期達(dá)到提高療效及臨床順應(yīng)性的目的。