HMGB1移位和釋放與肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制

劉樹(shù)雄，何 建

(上海東方肝膽外科醫(yī)院 急診科，上海200438)

造成肝臟缺血再灌注損傷后組織出現(xiàn)不可逆性的病理?yè)p傷的主要因素即炎癥因子的聯(lián)式的反應(yīng)與瀑布樣富集[1-3]。高遷移率族蛋白1(HMGB-1)屬于晚期炎癥因子，HMGB-1的表達(dá)在急性重型肝炎等多種肝臟疾病患者體內(nèi)異常升高，且HMGB-1的表達(dá)還關(guān)聯(lián)到患者預(yù)后。采用人工輸注的方式抑制肝部疾病患者血清的HMGB-1表達(dá)，可有效降低肝細(xì)胞的凋亡率[4-7]。本研究即探究大鼠發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷后肝組織中HMGB-1的表達(dá)，并分析其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取45只1月齡的雄性SD大鼠。購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 肝臟缺血再灌注模型的建立及分組

采用隨機(jī)數(shù)字法，將45例受試大鼠隨機(jī)分為三組，每組15只大鼠。術(shù)前12 h、術(shù)前1 h向HMGB1干預(yù)組受試大鼠腹腔輸注兔抗小鼠HMGBI抗體，分別與術(shù)前12 h、術(shù)前1 h向缺血再灌注組受試大鼠腹腔輸注生理鹽水，假手術(shù)組大鼠不采取任何預(yù)處理措施。缺血再灌注組及HMGB1干預(yù)組大鼠麻醉后，取仰位進(jìn)行固定，打開(kāi)腹腔，夾閉其肝門(mén)靜脈以及肝動(dòng)脈，1 h后恢復(fù)血流再灌注以制造肝臟缺血再灌注大鼠模型。假手術(shù)組大鼠打開(kāi)腹腔后不夾閉肝門(mén)靜脈及肝動(dòng)脈。

1.3 方法

1.3.1血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量 恒溫條件下應(yīng)用小鼠約70%的肝缺血再灌注模型，缺血再灌注后6 h斷尾取血，將血液樣本置于離心機(jī)內(nèi)以4 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清后保存于-80℃冰箱中待測(cè)；用自動(dòng)生化分析儀(BS-300型，邁瑞全)檢測(cè)大鼠血清ALT、AST含量。

1.3.2肝組織中細(xì)胞凋亡指數(shù) 肝細(xì)胞凋亡指數(shù)采用Annexin V-FITC/EGFP 細(xì)胞凋亡測(cè)試劑盒(上海翊圣公司)進(jìn)行測(cè)定，采用PBS洗滌正常培養(yǎng)以及誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞2次，加入100 μl Binding Buffer以及10 μl FITC標(biāo)記的Annexin-V(濃度20μg/mL)，室溫避光條件下靜置30 min后加入5 μl PI(濃度50 μg/mL)，避光條件下反應(yīng)5 min后加入Binding Buffer 400 μl，采用FAC Scan流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，陰性對(duì)照不加Annexin VFITC和PI。

1.3.3肝組織中MPO含量 取大鼠肝組織，采用濾紙將肝組織表面血滲液吸干后將其置于-80℃冰箱中冷凍；取出冷凍的肝組織，將其置于預(yù)冷的生理鹽水中進(jìn)行漂洗，隨后采用濾紙吸干水分，向適量肝組織中加入試劑二混勻，混勻后將0.1 ml試劑三加入0.9 ml組織勻漿中再次混勻，置于37℃水浴中15 min；向勻漿中依次加入試劑四以及顯色劑，置于37℃水浴中30 min；向勻漿中加入試劑七，充分混勻后，置于60℃水浴中10 min；取出，在460 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定OD值。MPO(U/g)計(jì)算公式=(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/×11.3肝組織量(g)。ELISA試劑盒購(gòu)自上海廣銳公司。

1.3.4肝組織中HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)測(cè)定 HMGB-1mRNA表達(dá)采用RT-PCR測(cè)定，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara公司，10 μl反應(yīng)體系的反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min、94℃變性3 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s，循環(huán)共計(jì)30次。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定的HMGB-1mRNA吸光度值表示。HMGB1蛋白表達(dá)采用ELISA試劑盒檢測(cè)：將HMGB-1單抗包被于酶標(biāo)板，加入試劑盒內(nèi)抗HMGB-1抗體以及親和素，加顯色底物和終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下吸光度值，HMGB-1蛋白通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算。

1.3.5ELISA法測(cè)定肝組織中炎性因子及氧化應(yīng)激水平 炎性因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)。氧化應(yīng)激指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，ELISA試劑盒購(gòu)自上海凱博生化試劑有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件(美國(guó)IBM公司)；計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，比較采用χ2分析；P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能指標(biāo)

缺血再灌注組ALT、AST水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；HMGB1干預(yù)組ALT、AST水平高于假手術(shù)組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組受試大鼠肝功能指標(biāo)比較

2.2 三組受試大鼠肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

缺血再灌注組肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)高于假手術(shù)組(P<0.05)；HMGB1干預(yù)組高于假手術(shù)組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三組受試大鼠肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.3 肝組織中MPO含量

缺血再灌注組肝組織中MPO含量高于假手術(shù)組(P<0.05)；HMGB1干預(yù)組肝組織MPO含量高于假手術(shù)組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組受試大鼠肝組織中MPO含量比較

2.4 三組受試大鼠肝組織中HMGB1mRNA及蛋白表達(dá)比較

缺血再灌注組肝組織HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)；HMGB1干預(yù)組肝組織HMGB1 mRNA及蛋白低于缺血再灌注組，但高于假手術(shù)組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 肝組織中HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)

2.5 肝組織中炎性因子表達(dá)

缺血再灌注組炎性因子高于假手術(shù)組，HMGB1干預(yù)組低于缺血再灌注組、高于假手術(shù)組(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 肝組織中炎性因子表達(dá)

2.6 氧化應(yīng)激水平

大鼠氧化應(yīng)激水平檢測(cè)結(jié)果顯示，缺血再灌注組受試大鼠SOD明顯低于假手術(shù)組，HMGB1干預(yù)組明顯高于缺血再灌注組、低于假手術(shù)組，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺血再灌注組受試大鼠MDA明顯高于假手術(shù)組，HMGB1干預(yù)組明顯低于缺血再灌注組、高于假手術(shù)組，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)表6。

表6 氧化應(yīng)激水平比較

3 討論

肝缺血再灌注損傷屬于病理生理學(xué)事件之一，對(duì)患者的肝臟功能造成嚴(yán)重影響。目前關(guān)于肝缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未完全明確，因此在其預(yù)防以及治療方面均無(wú)效果顯著的方法。HMGB1屬于HMG蛋白超家族成員之一，是普遍存在的一種DNA結(jié)合蛋白[8]。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，免疫或非免疫細(xì)胞會(huì)向胞外環(huán)境釋放HMGB1，多種炎癥及免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制可能與這一過(guò)程相關(guān)。已有學(xué)者提出，HMGB1的移位與釋放與肝臟缺血再灌注損傷的進(jìn)展相關(guān)，HMGB1可能是該損傷機(jī)制中的一種重要的調(diào)控因子[9-11]。本研究中，缺血再灌注組受試大鼠肝組織中HMGB1水平以及細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組，而術(shù)前輸注抗HMGB1抗體的干預(yù)組受試大鼠肝組織中HMGB1水平以及細(xì)胞凋亡指數(shù)則明顯低于缺血再灌注組，但仍高于假手術(shù)組，提示在大鼠肝臟缺血再灌注損傷后，肝組織中HMGB1含量明顯上升、細(xì)胞凋亡率增加，而建模前腹腔輸注抗HMGB1抗體則可以有效環(huán)緩解這一現(xiàn)象，由此可以推斷在肝臟缺血再灌注損傷及修復(fù)過(guò)程中HMGB1扮演重要角色[12,13]。

本研究采用ELISA法檢測(cè)大鼠肝組織中TNF-α、IL-6炎性因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組受試大鼠明顯高于假手術(shù)組，HMGB1干預(yù)組則明顯低于缺血再灌注組、但仍高于假手術(shù)組，提示抗HMGB1抗體改善大鼠肝臟缺血后再灌注損傷可能是通過(guò)下調(diào)TNF-α及IL-6水平實(shí)現(xiàn)。SOD是機(jī)體清除氧自由基的主要成分之一， MDA是一種體內(nèi)氧化應(yīng)激的終末產(chǎn)物，本文研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組受試大鼠SOD水平明顯低于假手術(shù)組、MDA水平明顯高于假手術(shù)組，而采用抗HMGB1抗體干預(yù)后，大鼠SOD水平明顯升高、MDA水平明顯降低，提示HMGB1干預(yù)降低了肝臟缺血再灌注損傷大鼠的氧化應(yīng)激程度減輕，其與HMGB1介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞積聚以及促炎因子趨化相關(guān)。

綜上所述，大鼠肝臟缺血再灌注損傷后，HMGBI表達(dá)顯著上升，輸注HMGBI抗體可有效改善大鼠肝臟缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)炎性因子表達(dá)、降低炎癥引起的細(xì)胞凋亡相關(guān)。