神經(jīng)生長因子對(duì)牙周炎犬即刻種植骨結(jié)合影響的實(shí)驗(yàn)研究

張 艷，王 偉，劉 新，袁 琳，劉 聰

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130033;2.泰安市中心醫(yī)院 口腔科，山東 泰安271000)

牙周炎在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高達(dá)90%，已成為了成年人牙缺失的最主要原因。目前，種植修復(fù)是牙缺失患者極為重要的修復(fù)方法之一。牙周炎雖然不是口腔種植修復(fù)的絕對(duì)禁忌癥，但種植失敗風(fēng)險(xiǎn)較高，尤其即刻種植。因此，如何提高牙周炎患者拔牙后即刻種植的成功率是目前研究的熱點(diǎn)。

神經(jīng)生長因子(NGF)具有促進(jìn)骨折愈合的能力[1,2]。NGF能促進(jìn)血管生成，且在不同鈦表面能提高內(nèi)皮細(xì)胞增殖和基因的表達(dá)，并有抗炎作用，可能對(duì)種植體周圍早期骨結(jié)合有一定促進(jìn)作用[3-6]。但目前鮮有NGF對(duì)牙周炎患者拔牙即刻種植早期骨結(jié)合影響的文獻(xiàn)報(bào)道。為觀察NGF對(duì)牙周炎犬即刻種植早期骨愈合的影響，本實(shí)驗(yàn)建立犬前磨牙牙周炎模型，拔牙后行即刻種植術(shù)并局部應(yīng)用NGF，以期為臨床牙周炎即刻種植后局部應(yīng)用NGF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4只成年雄性健康比格犬，體健，口腔衛(wèi)生條件良好，無任何口腔疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

6號(hào)絲線、正畸結(jié)扎絲、牙周探針、高速渦輪手機(jī)、金剛砂車針、牙齦卟啉單胞菌(由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供)、韓國Mega種植體(直徑3.3 mm，長7 mm)、注射用鼠NGF(麗康樂)[麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，珠海，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字S20100005]臨用前每瓶用2 ml氯化鈉注射液溶解。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1犬牙周炎模型的建立 全身麻醉后，左、右兩側(cè)所有前磨牙牙頸部下使用渦輪手機(jī)制備一淺溝，正畸結(jié)扎絲及事先浸泡過牙齦卟啉單胞菌的6號(hào)絲線進(jìn)行結(jié)扎，在飼料中添加全脂奶粉、蔗糖各20 g，并在牙頸部每日涂抹牙齦卟啉單胞菌，每周對(duì)犬的牙周進(jìn)行觀察和探診。觀察指標(biāo)為：出血指數(shù)(bleeding index,BI)、菌斑指數(shù)(plaque index,PLI)。第4周末建模完成后，全麻下拆除絲線及結(jié)扎絲對(duì)犬的全口牙齒進(jìn)行牙周潔治，并拍攝螺旋CT，三維重建后測(cè)量釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x視為牙槽骨吸收量。

1.3.2種植手術(shù)及術(shù)后處理 第5周，集中一天由一名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的種植醫(yī)師對(duì)4只犬拔牙后行即刻種植術(shù)。全麻后，微創(chuàng)拔除左、右側(cè)下頜第二、三前磨牙，逐級(jí)擴(kuò)孔，即刻植入Mega種植體16枚，植入扭矩35N.cm以上，可吸收縫線嚴(yán)密縫合。術(shù)后流質(zhì)飲食，肌注青霉素鈉48萬U/只/天3天。選擇右側(cè)下頜作為對(duì)照組，左側(cè)下頜即為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組在種植體周圍骨膜下頰、舌側(cè)注射NGF，劑量為1.0 μg/d，注射2周；對(duì)照組種植體周圍骨膜頰、舌側(cè)注射相同體積的0.9%生理鹽水。術(shù)后4、8周各隨機(jī)選擇兩只犬用過量麻醉法處死，取含種植體的犬下頜骨標(biāo)本，生理鹽水沖洗、作好標(biāo)記后，10%的福爾馬林溶液浸泡備用。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1大體觀察 觀察種植術(shù)后植體有無松動(dòng)及周圍軟組織有無感染、炎癥和愈合狀況。

1.4.2X線觀察 對(duì)種植體及周圍軟、硬組織行X線檢查，觀察種植體周圍骨密度及結(jié)合狀況。

1.4.3組織形態(tài)學(xué)觀察 將標(biāo)本放在清水下連續(xù)沖洗12 h，不同濃度梯度酒精脫水、包埋，萊卡硬組織切片機(jī)切片，磨至厚度約為80 μm的磨片，甲苯胺藍(lán)染色，Olympus光學(xué)顯微鏡進(jìn)行種植體-骨整合的觀察。

1.4.4骨計(jì)量學(xué)分析及數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Image-pro plus 6.0對(duì)每個(gè)植體的骨結(jié)合率進(jìn)行計(jì)算，選擇種植體頰側(cè)及舌側(cè)作為觀察區(qū)域。骨結(jié)合率為種植體與新生骨組織接觸的長度與種植體在骨界面的長度的比值乘以100%。對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPASS17.0進(jìn)行處理，并采用單因素方差分析進(jìn)行比較。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周炎模型及評(píng)估

2周后下頜兩側(cè)前磨牙的牙齦出現(xiàn)炎癥癥狀：牙齦紅腫充血，探診容易出血，BI為1-3， PLI為1-2。結(jié)扎4周后，下頜前磨牙牙頸部可見大量的牙菌斑及軟垢、探及牙石，BI為3-4， PLI為2-3，牙齒松動(dòng)Ⅰ-Ⅱ度，螺旋CT三維重建顯示下頜前磨牙處的牙槽嵴頂明顯吸收，為牙周炎的臨床表現(xiàn)，提示牙周炎犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?。?duì)兩組2、4周BI、PLI及4周牙槽骨吸收量進(jìn)行對(duì)比分析(表1)，結(jié)果均顯示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 大體觀察

術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)食、活動(dòng)正常，均無死亡。手術(shù)部位愈合良好，未發(fā)生炎癥反應(yīng)及手術(shù)并發(fā)癥，未出現(xiàn)植體的松動(dòng)、脫落，金屬口鏡柄端敲擊種植體頂部聲響清脆。

表1 4周下頜骨兩側(cè)第二、三前磨牙牙槽骨吸收量對(duì)比

2.3 X線觀察

X線片上未顯示異常骨吸收區(qū)域。術(shù)后4周，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組植體周圍均顯示有放射性透射區(qū)，與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組種植體周圍透射區(qū)明顯。術(shù)后8周，較4周各組種植體周圍區(qū)域與正常骨組織更接近，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比種植體周圍投射區(qū)稍明顯(圖1)。

A：4周對(duì)照組；B：4周實(shí)驗(yàn)組；C：8周對(duì)照組；D：8周實(shí)驗(yàn)組

2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后4周：對(duì)照組植體與骨組織之間有部分結(jié)合，較多的纖維結(jié)蹄組織形成，可見類骨質(zhì)，骨小梁比較稀疏；實(shí)驗(yàn)組植體與骨組織之間結(jié)合區(qū)域相對(duì)較多，相對(duì)較少的纖維結(jié)締組織成分，類骨質(zhì)開始形成，連續(xù)的骨小梁出現(xiàn)。術(shù)后8周：兩組種植體周圍骨組織均較4周時(shí)更成熟、致密。對(duì)照組，新生骨組織較多，骨小梁比較規(guī)則；實(shí)驗(yàn)組類骨質(zhì)礦化程度高，骨小梁均勻整齊，新生骨組織致密，骨組織直接與種植體結(jié)合范圍更廣(圖2)。

A：4周對(duì)照組；B：4周實(shí)驗(yàn)組；C：8周對(duì)照組；D：8周實(shí)驗(yàn)組

2.5 骨計(jì)量學(xué)分析

術(shù)后4、8周：對(duì)照組種植體骨結(jié)合率明顯低于實(shí)驗(yàn)組，單因素方差分析兩組P均小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

3 討論

牙周炎是由細(xì)菌引起的牙周組織的進(jìn)行性破壞性疾病，伴隨牙周袋形成和炎癥、進(jìn)行性的附著喪失和牙槽骨的吸收。多種因素影響著牙周炎患者即刻種植的成功，良好的初期穩(wěn)定性是口腔種植成功的先決條件[7]。研究表明，術(shù)后4、8周牙周感染部位的種植相對(duì)于健康部位種植骨愈合率低[8]。牙周炎患者拔牙后牙槽窩的形態(tài)、局部炎癥及剩余骨量都可能影響植體的初期穩(wěn)定性，從而增加即刻種植失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 術(shù)后4、8周后的種植體骨結(jié)合率

NGF是具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促進(jìn)突觸生長功能的一種多胎蛋白，具有骨折愈合的潛能[1,2]。血管的生成對(duì)于種植體周圍骨再生和骨結(jié)合非常重要，Lazarovici等[3]證明了NGF與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)一樣具有促進(jìn)血管生成的能力。Guang等[4]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NGF可以促進(jìn)鈦表面血管形成和基因的表達(dá)。王亮等[5]經(jīng)過對(duì)兔股骨種植體周圍NGF的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)NGF的表達(dá)和骨愈合細(xì)胞的功能成正比。鮑艷娜等[9]將NGF應(yīng)用于兔下頜骨種植，發(fā)現(xiàn)NGF能縮短骨組織愈合時(shí)間，并提高種植體骨結(jié)合率。NGF可以提高骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，增強(qiáng)牙周成纖維細(xì)胞成骨性[10,11]。汪瓊等研究NGF對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，NGF可減少NO釋放從而發(fā)揮抗炎作用[6]。

良好牙周炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑹侵陵P(guān)重要的。犬與人類的牙周組織結(jié)構(gòu)相似，且一生同樣有乳、恒牙兩副牙齒。尤其比格犬性格溫順、大小適宜，常被用于牙周病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯縖12,13]。建立動(dòng)物牙周炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕校航Y(jié)扎法[14]、細(xì)菌涂抹法[15]、高塘黏性飲食法[16]等方式。為確保牙周炎犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒?，本?shí)驗(yàn)采用了以上3種方法聯(lián)合進(jìn)行造模。4周后所有犬左右兩側(cè)下頜前磨牙區(qū)均表現(xiàn)出牙齦炎癥、探診出血、牙齒松動(dòng)及牙槽嵴頂吸收的牙周炎臨床表現(xiàn)，提示造模成功。

本研究成功建立比格犬牙周炎模型后，拔出雙側(cè)下頜第二、三前磨牙后行即刻種植，并在種植體周圍局部注射NGF，術(shù)后4、8周，x線顯示實(shí)驗(yàn)組種植體周圍透射影均小于對(duì)照組，組織形態(tài)學(xué)顯示實(shí)驗(yàn)組種植體周圍新生骨量明顯高于對(duì)照組，骨計(jì)量學(xué)分析顯示實(shí)驗(yàn)組骨結(jié)合率明顯高于對(duì)照組，并且差異均具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NGF局部應(yīng)用于牙周炎拔牙后即刻種植，同樣可以加速種植體周圍新生骨的生成、促進(jìn)骨愈合，并提高種植體骨結(jié)合率，但其具體機(jī)制尚未完全明確，局部應(yīng)用NGF作為一種牙周炎種植的輔助手段應(yīng)用于臨床還需進(jìn)一步研究。