RP—HPLC法測(cè)定淫羊藿根中朝藿定C的含量

徐作剛 段萍 萬(wàn)紅才

【摘 要】 目的：建立測(cè)定淫羊藿根中朝藿定C的含量測(cè)定方法。方法：采用安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（25∶[KG-*3/5]75），等度洗脫，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm。結(jié)果：朝藿定C在0.973～9.729μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=1.0000，方法重復(fù)性、精密度等均滿足分析要求，方法回收率為102.3%，RSD為0.7%。結(jié)論：該方法測(cè)定淫羊藿根中朝藿定C的含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好。

【關(guān)鍵詞】 淫羊藿根；朝藿定C；高效液相色譜；含量測(cè)定

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）16-0017-03

淫羊藿根為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum （Sieb. Et Zucc.） Maxim、巫山淫羊藿Epimedium wushanenese T.S.Ying、天平山淫羊藿Epimedium myrianthum Steam、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim、氈毛淫羊藿Epimedium coactum H.R.Liang et W.M.Yan、粗毛淫羊藿Epimedium acuminatum Franch及光葉淫羊藿Epimedium sagittatum var. glabratum T.S.Ying的干燥根。具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕的功效，用于腎虛陽(yáng)痿、小便淋漓、咳喘、風(fēng)濕痹痛[1]。淫羊藿含有多種有效成分，其主要有效成分為淫羊藿苷類(lèi)黃酮化合物[2]，而其中的朝藿定C具有抗骨質(zhì)疏松、抗癌、免疫增加等廣泛的藥理活性[3-4]。課題前期進(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，朝藿定C的含量遠(yuǎn)高于淫羊藿苷等其他類(lèi)黃酮化合物，適宜定量分析。故選擇朝藿定C作為定量指標(biāo)用于淫羊藿根藥材的質(zhì)量控制。本文用反相液相色譜測(cè)定了11種貴州地產(chǎn)藥材淫羊藿根中朝藿定C的含量，可為淫羊藿根質(zhì)量控制及相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)提供理論根據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國(guó)安捷倫1260高效液相色譜儀，上海科導(dǎo)SK250LHC超聲波清洗器，瑞士梅特勒托利多AG135和AL204電子天平，北京普析TU-1901紫外分光光度計(jì)。

1.2 材料 朝藿定C對(duì)照品（含量95.5%，批號(hào)：111780-201503，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙腈（色譜純，批號(hào)：20170403，天津科密歐）；95%乙醇（分析純，批號(hào)：20161105，天津科密歐）；純凈水（批號(hào)：20171201，娃哈哈）；淫羊藿根樣品分別采集自貴州各地共11批（采集信息見(jiàn)表1），樣品均經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定。樣品洗凈后曬干，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，即得供試樣品，置于干燥器中保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[5-6] 色譜柱：美國(guó)安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶[KG-*3/5]75）；流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270nm。理論板數(shù)以朝藿定C峰計(jì)算均不低于6000。

2.2 對(duì)照品溶液配制 精密稱(chēng)取朝藿定C對(duì)照品50.94mg置50mL量瓶中，加50%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液5mL置20mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，即得（0.243mg/mL）。

2.3 供試品溶液配制[5-6] 取供試樣品約0.2g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱(chēng)定重量，放置過(guò)夜，超聲60分鐘（50kHz），放冷，再稱(chēng)定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 峰純度考察 取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，依法測(cè)定。朝藿定C峰的紫外掃描光譜表明：朝藿定C對(duì)照品的紫外掃描圖在200nm、270nm和320nm處有最大吸收。3D圖譜顯示：200nm波長(zhǎng)處吸收大但雜質(zhì)干擾較多，320nm波長(zhǎng)處干擾少但吸收較小，270nm波長(zhǎng)處吸收值較大且干擾少。供試品溶液中朝藿定C峰的紫外掃描圖與對(duì)照品峰的紫外掃描圖譜一致，且純度因子達(dá)到999以上。綜合以上考察，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1、2、4、6、8mL分別置10mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，得一系列濃度級(jí)別的對(duì)照品溶液；精密吸取上述系列對(duì)照品溶液和對(duì)照品貯備液各10μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，朝藿定C回歸方程為：y=18219.1343x+26.8045，r=1.0000，結(jié)果表明朝藿定C在0.0973～0.9730mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察 精密吸取2.2項(xiàng)下朝藿定C對(duì)照品溶液10μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，朝藿定C峰面積的RSD為0.14%，結(jié)果表明方法有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液分別于0、5、11、18h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定朝藿定C峰面積，RSD為0.6%，表明供試品溶液在18h內(nèi)穩(wěn)定性良好。[JP]

2.8 [JP2]重復(fù)性考察 稱(chēng)取同一供試品6份，按2.3項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣量10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。供試品中朝藿定C的平均含量為2.611%，RSD為0.4%，表明本方法重復(fù)性良好，符合定量標(biāo)準(zhǔn)要求。[JP]

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取8份已測(cè)定含量的樣品0.1g（朝藿定C含量為2.611%），分別置具塞錐形瓶中，精密加入回收對(duì)照溶液20mL，稱(chēng)定重量，放置過(guò)夜，超聲60min，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。朝藿定C的平均回收率為102.3%，RSD為0.7%，表明本方法準(zhǔn)確度良好，符合相關(guān)規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地供試樣品按2.3配制供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

為獲得準(zhǔn)確的含量測(cè)定結(jié)果，本研究考察了浸泡過(guò)夜、浸泡過(guò)夜后超聲、浸泡過(guò)夜后水浴回流、浸泡過(guò)夜后超聲再水浴回流等四種不同的提取方法，結(jié)果表明，浸泡過(guò)夜后超聲效果為最佳，增加水浴回流步驟反而使朝藿定C含量結(jié)果降低。文獻(xiàn)報(bào)道[7]，朝藿定C（三糖苷）在高溫環(huán)境下會(huì)脫去一個(gè)鼠李糖后轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷（二糖苷），導(dǎo)致朝藿定C含量下降、淫羊藿苷含量升高。因此選擇浸泡過(guò)夜后超聲作為本實(shí)驗(yàn)的提取方式。

實(shí)驗(yàn)中有3個(gè)樣本分別為黔嶺淫羊藿和水城淫羊藿，不在貴州省淫羊藿根藥材標(biāo)準(zhǔn)收載的品種中，但作為貴州特有品種，本研究也對(duì)這3個(gè)樣本進(jìn)行了含量測(cè)定，朝藿定C含量最低為0.86%，而標(biāo)準(zhǔn)收載的品種中，朝藿定C含量最低為0.89%。結(jié)果顯示，非標(biāo)準(zhǔn)品種中朝藿定C的含量也可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品種的含量水平，建議修訂淫羊藿根標(biāo)準(zhǔn)時(shí)增加收載品種，擴(kuò)大貴州省淫羊藿根來(lái)源的覆蓋范圍。

淫羊藿根作為貴州省少數(shù)民族常用藥材，收載于《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，但標(biāo)準(zhǔn)中僅有一項(xiàng)性狀描述，不能有效控制藥材的質(zhì)量。已有文獻(xiàn)研究對(duì)象多為淫羊藿藥材，按《中國(guó)藥典》一部定義為淫羊藿的干燥葉[8]。淫羊藿植株入藥部位不同，有效成份含量也有所差異，本研究可為淫羊藿根藥材的標(biāo)準(zhǔn)制定、醫(yī)療應(yīng)用和質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)參考。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2018-06-07 編輯：程鵬飛）