清熱養(yǎng)陰丹抑制大鼠口腔潰瘍的發(fā)生與腸道菌群改善的關(guān)系研究*

陳夏涼 袁 曉 夏濤濤

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310003 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006 3 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

筆者在臨床治療中采用清熱為主，佐以養(yǎng)陰作為治療大法，運(yùn)用以“清熱養(yǎng)陰丹”為基礎(chǔ)方的清熱養(yǎng)陰法治療口腔潰瘍，取得較好的臨床療效。很多研究發(fā)現(xiàn)中藥比如黃連、靈芝、麥冬等可以直接與腸道菌群相互作用，改善腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)和多樣性，發(fā)揮對(duì)機(jī)體的代謝調(diào)控作用[1-3]。因此，筆者推測(cè)清熱養(yǎng)陰丹具有直接調(diào)控腸道菌群的作用，這可能是清熱養(yǎng)陰丹治療口腔潰瘍的重要原因之一。故用實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：60只SPF級(jí)健康SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g。清熱養(yǎng)陰丹藥物(生地、生石膏各30g，玄參24g，貝母、麥冬各15g，白芍、丹皮、梔子各12g，黃連、甘草各9g，山豆根6g，加10倍量水浸泡30分鐘后，煎煮

1小時(shí)，提取2次，過濾，濃縮至1g/ml密度的濃縮液)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司），核酸電泳儀器（美國(guó)伯樂公司），超聲粉碎機(jī)（美國(guó)SONICS公司），超低溫冰箱（美國(guó)賽默飛公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.3.1 動(dòng)物分組：隨機(jī)取40只，分5組，即正常組、模型組、清熱養(yǎng)陰丹治療高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組8只。剩余20只用于動(dòng)物造模。所有大鼠同室分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度18～24℃，相對(duì)濕度50%～60%，飼養(yǎng)1周適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 動(dòng)物模型制備：選用剩余的SD大鼠20只，二氧化碳處死，無菌條件下取口腔黏膜組織置超聲粉碎機(jī)磨成糊狀，取弗氏完全佐劑與口腔黏膜懸液按1∶1比例，在研磨時(shí)順同一方向逐滴加入黏膜抗原(1h加完)，加完后再研磨20rain以上，直至變?yōu)槿闋?即放置后不分層)為止。在SD大鼠脊柱兩側(cè)皮內(nèi)注射上述組織乳化劑，每只注射2點(diǎn)，每點(diǎn)0.1ml。間隔2周注射1次，共注射5次。由口腔專業(yè)人員觀察大鼠口腔黏膜確認(rèn)出現(xiàn)典型潰瘍病變，即為口腔潰瘍大鼠模型。

1.3.3 給藥劑量及方法：模型建立2小時(shí)后，各組開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)2周。清熱養(yǎng)陰丹治療高、中、低劑量組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按大鼠體重，分別以濃縮液6g/（kg·d）、3g/（kg·d）、1.5g/（kg·d）計(jì)算并稱取所需劑量濃縮液，溶于生理鹽水，制成2ml混懸液灌胃；正常組和模型組以2ml生理鹽水灌胃。期間各組大鼠均以普通無菌飼料喂養(yǎng)。

1.3.4 腸道菌群測(cè)定：糞便收集：于藥物治療2周后，以無菌方法收集大鼠糞便。將每只大鼠糞便分別放入滅菌EP管，立即放入-80℃保存。菌群DNA提?。悍Q取0.2g大鼠便樣，放入2ml無菌磁珠管中，采用酚氯仿異戊醇抽提法提取糞便樣品微生物總DNA。然后采用2次PCR擴(kuò)增16SrDNAV3區(qū)，以DNA為模板，采用Touchdown-PCR進(jìn)行第1次擴(kuò)增，再以第1次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行Reconditioning-PCR，二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腸道菌群變化。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量清熱養(yǎng)陰丹對(duì)大鼠口腔潰瘍的作用：在構(gòu)建模型過程中當(dāng)注射黏膜抗原的第2次（共5次）時(shí)，就發(fā)現(xiàn)大鼠口腔內(nèi)有不同程度的充血，第3次注射后1周大鼠即開始出現(xiàn)口腔潰瘍。中藥干預(yù)之后，發(fā)現(xiàn)中、高劑量的清熱養(yǎng)陰丹可顯著延長(zhǎng)大鼠口腔潰瘍的復(fù)發(fā)間隔時(shí)間。所有劑量都可以顯著減少口腔潰瘍的數(shù)量和面積大小。高劑量可顯著減少潰瘍持續(xù)的時(shí)間。見表1。

2.2 清熱養(yǎng)陰丹對(duì)腸道菌群的影響：稀釋曲線和Chao數(shù)據(jù)結(jié)果表明，筆者的測(cè)序深度足夠覆蓋了所有的菌群，測(cè)序結(jié)果有效(圖1A，B)。Chao數(shù)據(jù)表明模型組即口腔潰瘍的大鼠腸道菌群的菌群多樣性顯著低于正常對(duì)照組的大鼠。清熱養(yǎng)陰丹干預(yù)的低劑量和中劑量組可以提高菌群的多樣性，然而高劑量組并沒有增加腸道菌群的多樣性。β多樣性分析結(jié)果顯示高劑量組菌群與模型組菌群差異性最大，表明高劑量組對(duì)口腔潰瘍大鼠的腸道菌群影響最大(圖1C)。通過深入的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，清熱養(yǎng)陰丹干預(yù)后腸道菌群在不同水平上發(fā)生了變化。尤其是目水平上的Bacillales（圖1D）、科水平的Rikenellaceae(圖1E)和屬水平上的RC9-gut-group、Alistipes、Dorea、Gemella、hydrogenoanaerobacterium和Bamesiella的菌群的改變與口腔潰瘍模型組呈顯著發(fā)生密切相關(guān)。見表2。其中RC9_gut_group，在造模組中豐度增加，給藥后豐度降回正常比例，并且隨著劑量增加，這種恢復(fù)的幅度越大。

表1 不同劑量清熱養(yǎng)陰丹對(duì)大鼠口腔潰瘍的作用

圖1 清熱養(yǎng)陰丹干預(yù)后腸道菌群變化情況

表2 造模和用藥兩種處理都改變且相反的階元

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，口腔潰瘍屬于復(fù)發(fā)性“口瘡”范疇，其病因病機(jī)以“火”為主，其中脾胃伏火較為常見[4]。由于該病遷延反復(fù)，病久傷陰耗氣，氣陰損傷是本病遷延難愈、極易復(fù)發(fā)的內(nèi)在原因。筆者前期臨床病例診治已經(jīng)發(fā)現(xiàn)清熱養(yǎng)陰丹對(duì)口腔潰瘍的療效顯著優(yōu)于普通激素，遂希望通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步探究清熱養(yǎng)陰丹抑制口腔潰瘍發(fā)生的作用機(jī)制。通過構(gòu)建口腔潰瘍大鼠模型以及給予不同劑量的清熱養(yǎng)陰丹，筆者發(fā)現(xiàn)清熱養(yǎng)陰丹對(duì)大鼠口腔潰瘍的療效是呈劑量依賴性的。另外，通過腸道菌群的高通量測(cè)序分析研究發(fā)現(xiàn)清熱養(yǎng)陰丹可在不同水平上改變腸道菌群的豐度，尤其是可以逆轉(zhuǎn)模型組中改變的菌群，比如Bacillales和Rikenellaceae等（圖1D、E）。綜上，結(jié)果表明清熱養(yǎng)陰丹具有改善口腔潰瘍大鼠的腸道菌群的紊亂，這一作用可能與其抑制口腔潰瘍的治療作用密切相關(guān)。