基于GICT技術快速篩查水產品中氟苯尼考殘留

陳貴生，桑麗雅，桂 淦，榮朝振，方 凱，沈亞東，賴年悅*

(1.巢湖市柘皋鎮(zhèn)農村服務中心，安徽巢湖 238062；2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江杭州 310051；3.合肥市畜牧水產技術推廣中心，安徽合肥 230001)

氟苯尼考又稱氟代甲砜霉素，是與氯霉素活性相似的廣譜抗生素，對絕大多數革蘭氏陰性和陽性水產病原菌呈高度抗菌活性，具有高效、吸收快等特點，自面市以來得到廣泛應用。尤其是在氯霉素、硝基呋喃類抗生素被禁用后，氟苯尼考在水產品養(yǎng)殖中得到更加廣泛的使用。相對于氯霉素和甲砜霉素而言，氟苯尼考的毒性低、環(huán)境污染小、不易引起動物再生障礙性貧血，也不會致畸、致癌和致突變，但具有一定的免疫毒性和胚胎毒性。此外，氟苯尼考的使用也會使得水體中抗生素累積，破壞生態(tài)環(huán)境，對水產品質量安全造成影響。

20世紀90年代，在現(xiàn)代單克隆抗體技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的新型檢測技術——膠體金免疫層析技術(colloidal gold immunochromato graphic strip assay,GICT)，其原理是以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色反應，檢測抗原/抗體，此技術具有特異性強、操作簡便快捷、檢測成本低、無需特殊儀器設備等優(yōu)點，特別適用于廣大基層檢驗人員的現(xiàn)場檢測需要，已在醫(yī)學檢驗、毒品監(jiān)控、食品安全等領域得到廣泛應用[1-2]。目前，國內外的一些生物科技公司研發(fā)出水產品藥物殘留檢測的膠體金快速檢測試劑條或試劑盒，為膠體金免疫層析技術應用于水產品藥物殘留提供條件[3]。

為強化水產品質量安全監(jiān)管，加大監(jiān)測的范圍和頻率，自2013年5月起，合肥市在全省率先啟動水產品質量安全快速檢測工作，利用膠體金免疫層析技術對水產品中藥物殘留實施監(jiān)控，有力推動安徽省水產品市場準入制度和基地準出制度的實施[4]。筆者利用膠體金快速檢測試劑條，對采集的水產品組織中氟苯尼考殘留進行快速檢測，以期為水產品中的違禁藥物殘留監(jiān)控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。檢測樣品來源于水產品市場或養(yǎng)殖基地，將抽取的樣品帶回實驗室，取每份樣品的可食部分約100 g，用組織搗碎機充分絞碎混勻，裝入樣品袋，標明標識，冷凍保存，備用。

1.1.2試劑。所用試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。氟苯尼考抗原和抗體均來自杭州南開日新生物技術有限公司實驗室。濃鹽酸(HCl)純度>37%、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、乙酸乙酯(C4H8O2)、正己烷(C6H14)、甲醇(CH4O)、吐溫-20(C58H114O26)。

1.1.3設備。電子天平，感量0.01 g；均質機，轉速≥8 000 r/min；離心機，轉速≥4 000 r/min；氮氣吹干儀或空氣吹干儀，加熱溫度≥60 ℃；移液槍，1～10、10～100、100～1 000 μL；氟苯尼考膠體金免疫層析快速檢測試劑板組成(圖1)。

圖1 氟苯尼考膠體金快速檢測試劑盒的結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the structure of florfenicol colloidal gold rapid detection kit

1.2方法

1.2.1溶液制備。

1.2.1.11 mol/L鹽酸溶液。量取8.6 mL濃鹽酸，加蒸餾水定容至100 mL，室溫保存。

1.2.1.20.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5 %吐溫-20，pH 7.4)。溶解8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4、0.5 mL吐溫-20定容于800 mL水中，溶解并用水定容至1 L，用鹽酸溶液調整pH至7.4，經121 ℃滅菌15 min，4 ℃下避光保存。

1.2.1.3氟苯尼考標準儲備液(100 mg/L)。分別準確稱取10 mg氟苯尼考，用100 mL甲醇溶解，-18 ℃冰箱中保存，有效期180 d。

1.2.1.4氟苯尼考標準中間液(1 mg/L)。準確移取標準儲備液1 mL于1 000 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，4 ℃冷藏避光保存，有效期30 d。

1.2.2試樣制備。魚去鱗、去皮，取肌肉部分；蝦去頭、殼、腸腺，取肌肉部分。樣品的肌肉組織約50 g，剪碎，用均質機均質，備用。

1.2.3氟苯尼考快速篩查樣品前處理。稱取2 g(精確到0.1 g)備用樣品于5 mL離心管中，加入3 mL乙酸乙酯，劇烈振蕩3 min后，室溫下4 000 r/min離心5 min；用移液管移取2 mL 上清液于新的5 mL離心管中，至60 ℃下氮(空)氣吹干；然后向吹干的試管中依次加入0.3 mL正己烷和0.3 mL磷酸鹽溶液，充分混勻，并用滴管吸取試管內溶液沖洗管內壁上殘留物，靜置2 min，待檢。

1.2.4氟苯尼考殘留測定。取出氟苯尼考膠體金免疫層析快速檢測試劑板，置于平整的臺面上。吸取“1.2.3”中待測液100 μL于加樣孔中，在3～5 min讀取結果。以磷酸鹽緩沖液代替試樣提取液作為空白對照進行試驗。

1.2.5質控試驗。每一批次試驗時，選取已知未含氟苯尼考的均質水產品組織作為質控樣，稱取2份平行樣，其中一份作為陰性質控樣，另一份添加標準溶液使其終濃度為50 μg/kg，作為陽性質控樣。按“1.2.3”“1.2.4”方法與步驟進行試驗。

1.3結果判定

1.3.1判定方法。吸取待檢液垂直滴加3滴(約100 μL)于加樣孔中，加樣后開始計時按照規(guī)定時間內讀取結果(圖2)。陰性(-)：待測試驗檢測線(T線)出現(xiàn)紅色條帶，且顏色比控制線(C線)深或一樣深(圖3)為陰性，表明樣品中不含氟苯尼考或氟苯尼考殘留量<50 μg/kg。陽性(+)：待測試樣檢測線(T線)出現(xiàn)紅色條帶，但顏色比控制線(C線)淺或檢測線(T線)未出現(xiàn)紅色條帶(圖3)為陽性，表明樣品中氟苯尼考殘留量≥ 50 μg/kg。無效: 未出現(xiàn)C線(圖3)。

圖2 測試方法示意圖Fig.2 Schematic diagram of the test method

圖3 結果判定示意圖Fig.3 Schematic diagram of the result determination

1.3.2質控試驗要求。陰性質控樣結果應為陰性或陰性質控樣定量檢測濃度< 50 μg/kg；陽性質控樣結果應為陽性或陽性質控樣定量檢測濃度≥50 μg/kg，否則試驗無效。

1.3.3結果確認。該標準采用參比方法為GB/T 20756—2006《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》。如被檢測樣中氟苯尼考檢測結果為陽性時，可根據需要采用參比方法進行確證檢測。

2 結果與分析

2018年4—7月，合肥市畜牧水產技術推廣中心、合肥市漁政監(jiān)督管理站監(jiān)督抽查了該市養(yǎng)殖基地、水產品市場的鰱、鳙、鯽魚、鳊魚、草魚、河蟹、對蝦、多寶魚、鱸魚、甲魚等10個品種100多個樣品，應用膠體金快速篩查樣品中氟苯尼考藥殘指標。結果顯示，檢測限能達到≤50 μg/kg，符合國家規(guī)定的藥殘標準，一定程度上能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要，檢測方便，用時短，比儀器方法檢測節(jié)省了大量的時間。同時應用液相色譜-串聯(lián)質譜法對膠體金快速篩查的100份樣本(包括92份陰性樣本和8份陽性樣本)進行比對[5-6]，結果表明膠體金快速檢測與液相色譜-串聯(lián)質譜法的結果符合率為 95.4%。

膠體金免疫層析技術是基于抗原抗體特異性反應進行的檢測，所以在檢測實際樣本時，由于待檢樣品種類繁多、成分復雜，容易影響抗原抗體反應以及膠體金顆粒與蛋白的吸附，有的抗體特異不強且與目標物的結構類似物有交叉反應，加之免疫膠體金法是一種定性篩檢方法，所采用的檢測板是根據線與線的深淺對比進行判別，因樣品基質的不同，檢出限在一定范圍內波動，造成假陽性結果[7]。因此，對快速法檢出的陽性樣品應送實驗室用大型儀器檢測方法進行確證，以確保水產品質量安全。

3 結論與討論

國際上現(xiàn)在通用的水產品藥物殘留檢測方法是篩選加確證的方法，即首先采用一種簡便的方法對待檢測樣品進行快速篩選，然后采用準確性較高的方法對篩選結果為疑似陽性的樣品再進行確證分析[8]。膠體金免疫層析技術是利用試劑盒及試劑按照操作規(guī)程對水產品中的不同藥物殘留進行快速檢測，對其陽性樣品進行快速篩選，與精密儀器檢測技術相比，具有易攜帶、操作簡單、檢測成本低、快速準確、易保存和不受檢測條件限制等優(yōu)點。隨著科學技術的發(fā)展，膠體金免疫層析技術不僅發(fā)展?jié)摿薮螅沂袌龊蛻们熬皬V闊，特別適用于廣大基層檢驗人員的現(xiàn)場檢測需要，因此在未來的水產品藥物殘留檢測中，膠體金免疫層析技術將會成為重要的技術手段。

高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、液質聯(lián)用技術(HPLC/MS/MS)、氣質聯(lián)用技術(GC/MS/MS)、微生物法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和Charm Ⅱ 等是目前檢測水產品中藥物殘留的主要方法[9-10]，他們大多具有靈敏度高、重復性好等特點，特別是色譜法更具有確證能力，但這些方法存在檢測時間長、成本高和不易現(xiàn)場檢測等問題，難以滿足現(xiàn)場快速檢測要求，很難在普通養(yǎng)魚場、水產品市場，甚至中小型企業(yè)中普及應用，無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，給水產品質量安全監(jiān)管工作帶來許多不便。

要進一步研究膠體金免疫層析技術在水產品檢測中的應用，提高檢測靈敏度，實現(xiàn)多元檢測、定量或半定量檢測。在滿足檢測快速而簡便的條件下，應盡可能提高檢測的特異性和敏感度，減少假陰性和假陽性。另外，目前市面上的各種快速檢測產品質量良莠不齊，給監(jiān)管人員帶來不少麻煩，建議使用水產品專用，且經農業(yè)部或權威檢測機構驗證的快檢產品。