洋川芎內(nèi)酯I與血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定

李恩華 沈佳偉

【摘 要】 目的：研究洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合情況。方法：采用平衡透析法測(cè)定洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率，以液相質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定透析內(nèi)外液中洋川芎內(nèi)酯I的濃度，計(jì)算其血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果：血漿中其他成分對(duì)測(cè)定無干擾，洋川芎內(nèi)酯I在0.05～10μM濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，精密度及穩(wěn)定性結(jié)果均符合方法學(xué)要求；實(shí)驗(yàn)選擇紫杉醇為陽性對(duì)照，孵育8h后，紫杉醇與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合分別為92.3%～94.5% 和93.8%～97.2%，與文獻(xiàn)報(bào)道的范圍88%～98%一致。孵育8h后，洋川芎內(nèi)酯I與大鼠血漿蛋白結(jié)合率為83.5%～86.5%；與人血漿蛋白結(jié)合率為82.1%～83.9%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高，能滿足生物樣品的分析要求。洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合較強(qiáng) （> 80%）。

【關(guān)鍵詞】 洋川芎內(nèi)酯I；血漿蛋白結(jié)合率；平衡透析法；液相質(zhì)譜聯(lián)用

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）01-0044-04

Abstract：Objective To determine plasma protein binding ratio of senkyunolide I in rat and human plasma.Methods The plasma samples were precipitated by acetonitrile and analyzed by high performance liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS/MS）.The rapid equilibrium dialysis was carried out to determine the protein binding rate of senkyunolide I in rat and human plasma.Results The results showed that no substances from plasma interfered the determination of senkyunolide I.The calibration curve of the analytes was in good linearity in certain range of 0.05～10 μM.The precision and stability of the analytes met the methodology requirements.Taxol was used as the positive control， after incubation for 8 h， the binding ratio were 92.3%～94.5% and 93.8%～97.2% for rat and human， respectively， which was in accordance with the literature.The binding ratio of senkyunolide I were 83.5%～86.5% and 82.1%～83.9% for rat and human， respectively.Conclusion The method was proved to be simple， rapid and sensitive.And senkyunolide I displayed a high plasma protein binding ratio （> 80%）.

Keywords：Senkyunolide I；Plasma Protein Binding；Rapid Equilibrium Dialysis； LC/MS/MS

洋川芎內(nèi)酯I是傘形科植物川芎Ligusticum Chuanxiong Hort.的主要活性成分之一[1]。藥理研究表明，洋川芎內(nèi)酯I能夠透過血腦屏障對(duì)腦部疾病尤其是偏頭痛發(fā)揮一定的治療作用[2-3]。藥動(dòng)學(xué)表明，洋川芎內(nèi)酯I經(jīng)口服給藥后，能被快速吸收進(jìn)入血液循環(huán)，并不同程度地分布到各組織中[4]。

藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化過程中，可與組織蛋白（包括受體）和體液蛋白相結(jié)合，因此在組織和體液中除含有游離的藥物外，還含有結(jié)合的藥物。藥物與血漿蛋白的結(jié)合與藥物的體內(nèi)過程密切相關(guān)。如藥物與血漿蛋白呈濃度依賴性結(jié)合時(shí)引起非線性藥代動(dòng)力學(xué)。與藥物相結(jié)合的血漿蛋白主要是白蛋白、α1-酸性糖蛋白和脂蛋白[5]。白蛋白主要與有機(jī)酸類藥物結(jié)合，α1-酸性糖蛋白主要與有機(jī)堿類藥物結(jié)合。由于血漿蛋白中白蛋白含量最高，故有時(shí)單獨(dú)研究其與藥物的結(jié)合情況。因此，藥物與血漿蛋白的結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)研究的重要參數(shù)，它對(duì)藥物的組織分布、生物轉(zhuǎn)化、代謝等均產(chǎn)生重要影響，是新藥臨床評(píng)價(jià)不可缺少的指標(biāo)，尤其對(duì)毒性藥物的臨床應(yīng)用具有極其重要的指導(dǎo)意義。實(shí)驗(yàn)采用快速平衡透析裝置結(jié)合液相質(zhì)譜聯(lián)用分析方法測(cè)定洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率，為進(jìn)一步臨床研究提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 Thermo Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；Thermo TSQ Vantage三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DKZ-1型電子恒溫孵育箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Thermo Scientific平衡透析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）；Vortex-Genie 2型渦旋儀（美國MoBio公司）；Millipore Elix 5純水儀（密理博中國有限公司）。

1.2 材料 洋川芎內(nèi)酯I（純度>98%，成都德銳生物科技有限公司）；甲苯磺丁脲（純度>98%，中國食品藥品檢定研究院）；紫杉醇（純度>98%，中國食品藥品檢定研究院）；大鼠血漿（由單位藥理實(shí)驗(yàn)室提供，所用抗凝劑為EDTA-K2）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為Millipore Elix 5純水儀純化水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品適量，用DMSO配成濃度為40 mM的儲(chǔ)備液，移取儲(chǔ)備液適量用DMSO稀釋成400 μM、2000 μM的工作液，備用。精密稱取紫杉醇對(duì)照品適量，用DMSO配成濃度為40 mM的儲(chǔ)備液，移取儲(chǔ)備液適量用DMSO稀釋成400 μM的工作液，備用。

1.4 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取甲苯磺丁脲對(duì)照品適量，用DMSO配成濃度為10 mM的儲(chǔ)備液，移取儲(chǔ)備液適量用乙腈稀釋成1μM的工作液，備用。

1.5 分析條件 紫杉醇的分析方法與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。洋川芎內(nèi)酯I分析方法如下：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱 （50 × 2.1 mm i.d.， 1.7 μm）；柱溫45 °C；流動(dòng)相為水與乙腈梯度洗脫：0～1min，10%～50%乙腈；1～1.8 min，50%～90%乙腈；1.8～2.2min，10%乙腈。流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：10μL。

ESI 離子源；正離子檢測(cè)模式；離子源參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓 （spray voltage） 2.5 kV；噴霧溫度 （vaporizer temperature） 200 ℃；鞘氣流速（sheath gas） 40 unit；輔助氣流速 （aux gas） 10 unit；毛細(xì)管溫度 （capillary temperature） 300 ℃；碰撞氣（collision gas， argon） 1.5 mTorr；質(zhì)譜掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM），洋川芎內(nèi)酯I m/z 225.2→m/z 119.3， CE 24 eV；甲苯磺丁脲 m/z 271.1→ m/z 155.3， CE 24 eV。所有操作以及數(shù)據(jù)處理由Xcalibur （version 2.2）軟件控制。

1.6 透析液樣品預(yù)處理 在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)，分別從血漿室或緩沖液室中精密吸取50 μL，分別加入等量的空白PBS緩沖液或空白血漿，混合均勻后加入250 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合45 min，12000 rpm離心10 min后移取上層有機(jī)相于96-孔板中，吸取10 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.7 血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定 采用平衡透析法，透析膜在超純水中浸泡1 h，然后再在20%的乙醇溶液中浸泡過夜，實(shí)驗(yàn)前透析膜用超純水清洗3遍。精密移取4 μL洋川芎內(nèi)酯I工作溶液于1.5 mL離心管中，加入796 μL空白血漿，渦旋混合均勻后，移取50 μL該樣品于另一離心管中，作為T0樣品在室溫下放置8 h后同“1.6透析液樣品預(yù)處理項(xiàng)下處理”。該樣品用于測(cè)定其回收率。另取150 μL 上述血漿樣品于RED透析管的一側(cè)，在另一側(cè)加入等體積的磷酸緩沖液。每個(gè)樣品平行3份，用膠帶覆蓋密封，置于37℃恒溫水浴箱中孵育8 h。孵育結(jié)束后，按“1.6透析液樣品預(yù)處理項(xiàng)下處理”測(cè)定血漿室和緩沖液室中藥物濃度。陽性對(duì)照（紫杉醇）處理方法相同。

1.8 數(shù)據(jù)處理 血漿蛋白結(jié)合率以及回收率根據(jù)如下公式計(jì)算得到。

血漿蛋白結(jié)合率 （%）=100%×（C血漿-C緩沖液）/C血漿

回收率（%）=100%×（C血漿+C緩沖液）/C0

C血漿：透析達(dá)到平衡時(shí)血漿中待測(cè)物濃度；C緩沖液：透析達(dá)到平衡時(shí)緩沖液中待測(cè)物濃度；C0：T0樣品中待測(cè)物濃度。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 在擬定的分析條件下樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾洋川芎內(nèi)酯、紫杉醇以及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，保留時(shí)間分別為2.51、3.67 min，如圖1所示。

2.2 線性關(guān)系考察 取空白血漿45 μL，加入等體積的空白緩沖液，混合均勻后，加入標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液10μL，配成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μM的系列濃度溶液，按照1.6項(xiàng)下的方法處理后進(jìn)樣分析。以待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以加權(quán)最小二乘法（1/x2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 y=0.0425+0.075x，相關(guān)系數(shù)為r2=0.9989（圖2），結(jié)果表明在0.05～10μM濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度 取空白血漿45 μL，加入等體積的空白緩沖液，混合均勻后，加入標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液10 μL，配成濃度為0.1、1、8 μM的質(zhì)控樣本，按照1.6項(xiàng)下的方法處理后進(jìn)樣分析。每一濃度6樣本連續(xù)考察3d，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得濃度與標(biāo)示濃度比較，球的方法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果表明日內(nèi)、日間精密度RSD（%）均小于15%，準(zhǔn)確度RE（%）在± 10%以內(nèi)，表明該方法精密度與準(zhǔn)確度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別考察血漿樣品和緩沖液樣品在室溫、37℃條件下放置24 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，血漿樣品和緩沖液樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.5 平衡透析時(shí)間的確定 洋川芎內(nèi)酯I在37℃條件下與大鼠和人空白血漿孵育2、4、6、8、24 h后測(cè)定透析內(nèi)外液中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，結(jié)果顯示孵育8 h后，洋川芎內(nèi)酯I與血漿蛋白結(jié)合達(dá)到平衡。因此孵育時(shí)間選擇8 h。

2.6 陽性對(duì)照結(jié)果 以紫杉醇與血漿蛋白結(jié)合率作為陽性對(duì)照。驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)使用的平衡透析系統(tǒng)的可行性，結(jié)果樣品孵育8 h后紫杉醇與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合分別為92.3%～94.5% 和93.8%～97.2%。與文獻(xiàn)報(bào)道的范圍88%～98%一致。

2.7 洋川芎內(nèi)酯I血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定 洋川芎內(nèi)酯I在37℃條件下與空白血漿孵育8 h后，對(duì)血漿側(cè)和緩沖液側(cè)樣品處理后進(jìn)行分析。結(jié)果如表2所示，表明洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率較高，大于80%。且隨著濃度的升高，結(jié)合率無顯著性差異。

3 討論

藥物在血液中可以與包括血漿蛋白在內(nèi)的多種生物大分子形成復(fù)合物，但只有游離型藥物能夠產(chǎn)生藥理效應(yīng)。藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物體內(nèi)的重要參數(shù)之一。藥物的血漿蛋白結(jié)合不僅影響到藥物的分布，而且還影響到藥物的代謝和排泄等過程，更與藥理作用密切相關(guān)。洋川芎內(nèi)酯I在大鼠血漿中蛋白結(jié)合率在83.5%～86.5%，在人血漿中蛋白結(jié)合率為82.1%～83.9%，屬于和血漿蛋白高度結(jié)合的化合物，并且這種高結(jié)合率與濃度之間沒有相關(guān)性。高度結(jié)合化合物在臨床上會(huì)有一些特異性的體內(nèi)過程：延緩藥物經(jīng)腎排泄，延緩進(jìn)入細(xì)胞外液，從而影響藥物的分布，故在設(shè)計(jì)最佳給藥方案時(shí)，常需考慮藥物的血漿蛋白結(jié)合率。實(shí)驗(yàn)采用Thermo Scientific平衡透析裝置，與傳統(tǒng)的平衡透析系統(tǒng)相比，透析膜的表面積與體積比率高，能夠縮短平衡時(shí)間，且操作簡(jiǎn)單。透析管為一次性使用，可以避免交叉污染。

高血漿蛋白結(jié)合的藥物臨床使用容易產(chǎn)生安全性問題，只要有影響血漿蛋白結(jié)合的因素產(chǎn)生，游離藥物濃度可能成倍增加，造成副作用或毒性。一般認(rèn)為血漿蛋白結(jié)合率高于80%的藥物屬于高蛋白結(jié)合率藥物[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洋川芎內(nèi)酯I的蛋白結(jié)合率高于80%，屬于高蛋白結(jié)合藥物，提示在臨床用藥中要注意其它藥物與洋川芎內(nèi)酯I之間的相互作用，避免藥物相互作用引起洋川芎內(nèi)酯I游離血藥濃度的波動(dòng)而導(dǎo)致毒副作用。

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（收稿日期：2017-11-16 編輯：穆麗華）