重樓醇提物對三種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株的細胞毒性研究

周國燦 李曉倩 曾洪波

【摘 要】 目的：通過重樓醇提物對三種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株（U251、U87、T98G）進行細胞毒性檢測，觀察重樓醇提物的抗腫瘤活性。方法：乙醇冷浸法對重樓飲片進行提取，采用聚酰胺柱層析分離劃段獲得重樓醇提物的不同部位，通過MTT法對所得部位進行細胞毒性檢測。 結(jié)果：重樓醇提物中有3個分離組分作用于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞IC50值小于10μg/mL，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株表現(xiàn)出明顯的細胞毒性作用。 結(jié)論：重樓醇提物中存在抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株增殖的物質(zhì)，值得進一步開展相關(guān)研究。

【關(guān)鍵詞】 重樓；醇提物；膠質(zhì)瘤細胞；MTT；細胞毒性

【中圖分類號】R285.5 【文獻標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）01-0041-03

Abstract：Objective To explore the cytotoxicity induced by paridis ethanol extract on three kinds of glioma cells （U251，U87，T98G）. Methods The ethanol cold-maceration method is used to extract the anti-tumor active components from paridis. The samples are obtained with polyamide column chromatography separation from the paridis ethanol extracts. The cytotoxicity of samples is assessed by MTT assay.Results There are three samples showing strong cytotoxic effect and some of them have the 50% inhibition concentration （IC50） less than 10.0μg/mL. The cytotoxicity analysis shows the paridis ethanol extract having anti-tumor activities. Conclusion Paridis ethanol extract displays an inhibitory effect on these three kinds of glioma cells in vitro and it is worthy further research.

Keywords：Paridis； Ethanol Extract； Glioma Cell； MTT； Cytotoxicity

重樓來源于百合科植物云南重樓Paris polyphylla [JP]Smith var.yunnanensis （Franch.）Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis （Franch.） Hara的干燥根莖[1]。其性苦、微寒，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚、止咳平喘的功效，在癰腫疔瘡、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、抽搐驚風(fēng)、跌打扭傷等癥治療中均有很好的療效。扶正、祛邪是傳統(tǒng)中醫(yī)藥在腫瘤治療方面的兩大基本原則，其中清熱解毒為最主要的祛邪手段之一[2]。重樓組方對惡性腫瘤的熱癥及實癥有一定的治療效果，在惡性腫瘤治療方面的作用越來越受到研究者的關(guān)注，重樓對正常細胞毒性較小、抗腫瘤譜廣，重樓水提物、醇提物及其主要活性成分重樓皂苷和一些重樓單體（如皂苷I、Ⅱ、IV、gracillin、methylmotogracillin、重樓皂苷D等）在體外對食管癌、胃癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、宮頸癌、乳腺癌等多種實體癌均有較強的細胞毒性作用[3]。研究應(yīng)用乙醇冷浸法對重樓飲片進行提取，通過聚酰胺柱層析分離劃段獲得重樓醇提物的不同分離部位樣品，改良MTT法對人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株（U251、U87、T98G）進行細胞毒性檢測，二甲基亞砜（DMSO）設(shè)為空白對照組，順鉑（DPP）為陽性對照組，對活性測試結(jié)果進行分析比較，初步探討重樓醇提物的體外抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗試劑 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株（U251、U87、T98G）購自中國科學(xué)院上海細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；順鉑（DDP，山東齊魯制藥廠）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、EDTA、胰蛋白酶、DPBS均購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；其余有機試劑均為國產(chǎn)分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 XD-2型倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；Synergy-HT型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；2306-2型CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；ZW-AZ型微量振蕩器（常州國華電器有限公司）；SC-3610型臺式低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；96孔細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）。

1.3 重樓醇提物制備 重樓飲片（產(chǎn)自云南麗江），飲片中加入15倍體積的70%乙醇熬煮3遍，每次2h，所得乙醇液合并后濃縮，石油醚脫脂，待其揮發(fā)干燥后稱浸膏重。

1.4 樣品的配制 重樓實驗組樣品：取20g重樓浸膏水溶后上聚酰胺柱，分別用水及不同比例的含水甲醇洗脫，定量收集，分別濃縮純化后冷凍干燥，共獲得13個部位的樣品，編號為RL01～RL13。取樣品1mg加入20μL DMSO使其溶解，再用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成質(zhì)量濃度為75、25、8.33、2.78μg/mL的樣品溶液。

陽性對照組樣品：使用RPMI-1640培養(yǎng)基將質(zhì)量濃度為1mg/mL的DDP溶液稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為10.00、3.33、1.11、0.37μg/mL的樣品。

1.5 細胞毒性檢測 將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、U87、T98G細胞株分別置于含10%新生牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞達到80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，選用第3代神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞做細胞毒性實驗研究，調(diào)整細胞濃度為 2×105/mL，將細胞重懸后接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24h后在每個實驗孔中分別加入50SμL測試樣品溶液，每個濃度樣品設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（DMSO） 和陽性對照組（DDP），繼續(xù)培養(yǎng) 48h后，于每個實驗孔中加入10μL 預(yù)先用生理鹽水配制好的MTT 檢測液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育 6h，沿培養(yǎng)孔邊緣輕柔將上清液吸去，實驗孔中分別加入DMSO 100μL，培養(yǎng)板放置于微量振蕩器上，振蕩 5min直至甲臜完全溶解，使用酶標(biāo)儀 在570nm 處測定吸光度OD值，使用下面的公式計算樣品對腫瘤細胞的生長抑制率，抑制率（%）= （OD空白-OD樣品） / OD空白×100%，通過SPSS 13.0統(tǒng)計軟件計算獲得IC50值。

2 結(jié)果

用聚酰胺層析分離劃段所得的重樓醇提物13個部位樣本中，除編號為RL01～RL03及RL13樣品對所選三株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞均沒有抑制作用外，RL04～RL12樣品至少對一株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞表現(xiàn)出細胞毒性作用。RL06～RL08樣品對三株膠質(zhì)瘤細胞均表現(xiàn)出較強的細胞毒性效應(yīng)。就同一部位而言，三種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株的細胞毒性相差較大，表明活性部位對不同類型腫瘤細胞的抑制（或殺滅）作用具有一定的選擇性。在三株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中，活性部位對U251的細胞毒性強于U87和T98G細胞，同時高活性部位（RL07）的半數(shù)抑制濃度（IC50）值已達到陽性藥物順鉑（DPP）的三分之一，作為藥物的粗提部位，已經(jīng)具有了較強的細胞毒活性。結(jié)果見表1。

表中數(shù)據(jù)為4次重復(fù)實驗的平均值，“-”表示IC50值大于100μg/mL，認(rèn)為無明顯細胞毒活性，表中未列出數(shù)據(jù)。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一類發(fā)生于神經(jīng)外胚層的中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲快、治愈率低、細胞具有異質(zhì)性，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率及死亡率常年居高不下。在原發(fā)性腫瘤中神經(jīng)膠質(zhì)瘤的比例高達40%～60%[4]。依據(jù)分化程度的差異，神經(jīng)膠質(zhì)瘤可分為星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤等，其中膠質(zhì)母細胞瘤及星形細胞瘤的患者，術(shù)后一年內(nèi)最大生存率僅為5%[5]。目前，神經(jīng)膠質(zhì)瘤主要的治療手段有手術(shù)、放療及化療，膠質(zhì)細胞瘤具有分化程度低、侵襲性強及增殖迅速的特點，常規(guī)手術(shù)治療手段不能徹底切除腫瘤細胞。隨著放療時間的延長，腫瘤細胞對輻射的敏感性下降，從而增加了殘存病灶復(fù)發(fā)的概率。腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性、個體對藥物的敏感性、腫瘤及周邊水腫組織間隙的靜水壓高等因素都使得神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的化療效果不佳[6]。惡性膠質(zhì)瘤尤其是低分化膠質(zhì)瘤手術(shù)治療的局限性，使神經(jīng)膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率和死亡率都很高，一般而言，患者術(shù)后平均生存時間常不超過一年，因此，怎樣將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞徹底清除仍然是研究人員面臨的一大難題，尋找療效好、副作用小的化療藥物是當(dāng)今神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中的主要研究方向之一。

中藥重樓及其活性成分主要通過以下機制發(fā)揮抗腫瘤作用：①抑制腫瘤細胞增殖誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；②抑制腫瘤血管生長；③調(diào)節(jié)機體免疫功能；④逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥性[7]。重樓醇提物、水提物對人肺腺癌（A549）、人胰腺癌（PANC-1）、人結(jié)腸癌（SW480）、人腎腺癌（A496）、人乳腺癌（MCF-7）、人前列腺癌（PC-3）等多種類型的腫瘤細胞均有細胞毒作用。重樓中甾體皂苷、植物蛻皮激素、植物甾醇等甾體類化合物含量豐富，其中甾體皂苷是其主要的活性物質(zhì)[8]。孫治國等[9]報道，醇提物比水提物提取出的重樓總皂苷更多，且70%乙醇提取總皂苷的獲得率最高。因此，研究采用70%乙醇冷浸法對重樓飲片進行提取，通過聚酰胺柱層析分離劃段得到重樓醇提物，共獲得13個樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重樓醇提物中不同活性部位的抗腫瘤活性具有一定差異。但當(dāng)中藥抗腫瘤部位活性測試結(jié)果IC50值小于10.0μg/mL時，有價值對其進行進一步開展研究。體外研究結(jié)果初步證實，重樓醇提物確實存在具有對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞抑制（或殺滅）作用的活性物質(zhì)，重樓醇提物對神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的臨床意義值得進一步的研究探討。

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（收稿日期：2017-11-21 編輯：穆麗華）