普洱熟茶茶多糖對ApoE—/—小鼠動脈粥樣硬化的作用研究

張曉明　王鵬　羅紹忠　楊繼紅 侯艷 邵宛芳 徐湘婷

【摘 要】 目的：探討普洱熟茶提取物茶多糖對ApoE-/-小鼠高脂血癥和動脈粥樣硬化的作用。方法：24只ApoE-/-小鼠隨機分為ApoE-/-對照組、茶多糖組、洛伐他汀組，另設(shè)8只相同遺傳背景的C57BL/6J 小鼠為ApoE+/+對照組。4組分別給予蒸餾水、茶多糖、洛伐他汀、蒸餾水12周，實驗結(jié)束后檢測血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量；ELISA檢測血清白介素-6（IL-6）及脂聯(lián)素（APN）的含量；光鏡觀測主動脈病理形態(tài)學變化。結(jié)果：與ApoE-/-對照組相比，茶多糖組體重明顯減輕（P<0.05）；TG、TC和LDL-C明顯降低，HDL-C明顯升高（P<0.05）；血清IL-6水平降低，APN水平升高（P<0.05）；光鏡下主動脈損傷病變程度減輕。結(jié)論：普洱熟茶茶多糖有調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠血脂、保護血管內(nèi)皮抗動脈粥樣硬化的作用，作用機制可能與其抗炎作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 ApoE-/-小鼠；動脈粥樣硬化；茶多糖；白介素-6；脂聯(lián)素

【中圖分類號】R453 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）08-0027-04

Abstract：Objective To explore the effect of tea polysaccharides（TPS） from fermented Puer tea on atherosclerosis （AS） in ApoE-/- mice.Methods ApoE-/- mice were divided into 3 groups （n=8）： ApoE-/- control group， TPS group and lovastatin group. The mice of C57BL/ 6J were used as the ApoE+/+ control group（n=8）. The 4 groups of mice were administered with distilled water，TPS or lovastatin for 12 weeks. Triglyceride （TG）， total cholesterol（TC）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） levels were assayed. The concertrations of IL-6 and APN in serum were measured by ELISA. Pathomorphology changes of aortas were observated. Results The comparison between TPS group and ApoE-/- control group revealed that： Bodyweights were reduced obviously in TPS group（P<0.05）. Serum levels of TG，TC and LDL-C were decreased significantly in TPS group（P<0.05）.The contents of IL-6 were lowered markedly， and the level of APN increased obviously in TPS group（P<0.05）. The aortas pathological changes were relieved obviously in TPS group. Conclusions TPS from fermented Puer tea can regulate blood lipid levels and bodyweights of ApoE-/- mice.TPS can protect vascular endothelial cells to inhibit the development of atherosclerosis， and this mechanism may be related with anti-inflammation.

Keywords：ApoE-/- Mice； Atherosclerosis； Tea Polysaccharides； IL-6； APN

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是與血脂代謝異常、內(nèi)皮受損、平滑肌細胞增殖和血栓形成等有關(guān)的慢性炎癥性疾病[1-2]。隨著生活水平的提高和人口老齡化的日益嚴重，AS 的發(fā)病率越來越高，成為了世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因。研究顯示，異常的脂質(zhì)代謝和慢性炎癥在AS 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。適當調(diào)整血脂水平能有效地降低動脈粥樣硬化發(fā)病率[3-4]。臨床上大多數(shù)降低血膽固醇水平的方法，需要嚴格控制飲食并依賴于藥物，而降血脂藥物的副作用使其應(yīng)用受到了一定程度的限制。因此開發(fā)能夠明顯調(diào)節(jié)血脂的功能食品，對降低動脈粥樣硬化的發(fā)病率具有重要的意義。普洱茶是云南特有的地理標志產(chǎn)品，是以符合普洱茶產(chǎn)地環(huán)境條件的云南大葉種曬青茶為原料，按特定的加工工藝生產(chǎn)的具有獨特品質(zhì)特征的茶葉。分為普洱生茶和普洱熟茶兩大類型[5]。本次實驗們使用載脂蛋白E基因敲除小鼠（Apolipoprotein E gene knockout mice， ApoE-/- mice）的動物模型，研究普洱熟茶中的茶多糖（Tea polysaccharides，TPS）抗ApoE-/-小鼠高脂血癥和動脈粥樣硬化的作用，為進一步有效地開發(fā)利用普洱茶，提供科學依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6J 小鼠8只，雄性，（20±2）g，第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院，SCXK（渝）2007-0008；SPF級C57BL/6J ApoE敲除小鼠24只，雄性，（20±2）g，北京大學實驗動物中心，SCXK（京）2006-0008。

1.2 受試物劑量設(shè)置及分組

1.2.1 受試物 普洱熟茶茶多糖由云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院制備提供，4 ℃低溫冷藏保存。所用茶葉樣品由三個機構(gòu)提供的不同來源的普洱茶熟餅1∶1∶1混合：①云南龍潤茶業(yè)集團云南農(nóng)大龍潤普洱茶學院監(jiān)制；②中國普洱茶研究院研制，云南省思茅茶樹良種場生產(chǎn)；帕卡；③云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究院西雙版納普洱茶研究院，勐?？h云茶科技有限責任公司。

1.2.2 動物及分組 24只ApoE-/-小鼠隨機分為3組：ApoE-/-對照組、茶多糖組、洛伐他汀組，每組8只動物；8只C57BL/6J 小鼠為ApoE+/+對照組。4組動物給予基礎(chǔ)飼料，分別給予蒸餾水、茶多糖（500 mg/kg·bw）、洛伐他汀（10 mg/kg·bw）、蒸餾水。采用經(jīng)口灌胃，給藥容量均為0.2ml/10 g，每天早上9∶00～11∶00給藥一次，連續(xù)給藥12周[6-8]。

1.3 儀器 TMS-1024全自動生化分析儀（日本京都）；Diagnostics Ins.KDC-2046離心機（中國科技大學科技實業(yè)總公司中佳光電儀器分公司）； BIO-RAD 550酶標儀（美國BIO-RAD公司）；Leica ASP200脫水機、Leica RM2145切片機、Leica EG1160包埋機均為德國萊卡公司；Nikon 50i顯微鏡及Mivnt圖像分析系統(tǒng)（北京唯恩視信科技有限公司）。

1.4 觀察指標

1.4.1 實驗結(jié)束后，所有動物禁食不禁水12 h，摘眼球取血，4 ℃，3000 r/min離心10 min，取血清，放入-80 ℃ 冰箱冷凍待測。檢測甘油三酯（Triglyceride， TG）、總膽固醇（Total Cholesterol， TC）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C）的含量；ELISA檢測血清白介素-6（Interleukin-6， IL-6）及脂聯(lián)素（Adiponectin， APN）。

1.4.2 從主動脈弓到髂總動脈分叉處摘取主動脈全段進行病理組織學檢查。以“？”表示主動脈基本正常；“+”表示輕度病變，內(nèi)膜完整性破壞，有泡沫細胞聚集，病變程度達到脂紋期甚至纖維斑塊期；“++”表示中度病變，病變程度達到纖維斑塊甚至是粥樣斑塊期；“+++”表示重度病變，出現(xiàn)斑塊破裂、血栓、內(nèi)出血、潰瘍、動脈瘤等復(fù)合病變。

1.5 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)加減標準差（x[TX-*3]±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析（方差齊）或者秩和檢驗（方差不齊），等級資料采用秩和檢驗，以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 普洱熟茶TPS對ApoE -/-小鼠體重的影響 普洱熟茶TPS連續(xù)給藥8周、12周后體重均顯著低于ApoE -/-對照組（P<0.05），提示普洱熟茶TPS有明顯降低ApoE -/-小鼠體重的作用。見表1。

2.2 普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠TG、 TC、LDL-C、HDL-C的影響 茶多糖組與ApoE-/-對照組相比，TC、TG、LDL-C含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示普洱熟茶TPS能降低ApoE-/-小鼠血脂TC、TG、LDL-C水平。茶多糖組與ApoE-/-對照組相比，HDL-C含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示普洱熟茶TPS能增加ApoE-/-小鼠血脂HDL-C水平。茶多糖組與洛伐他汀組相比，TG、TC、LDL-C及HDL-C水平差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示普洱熟茶TPS調(diào)節(jié)血脂作用要弱于洛伐他汀組2。見表2。

2.3 主動脈病理學檢查 由表3、圖1可知，ApoE +/+對照組小鼠主動脈壁厚薄均勻，內(nèi)膜、中膜和外膜未見異常。內(nèi)膜完整，未見泡沫細胞聚集，無動脈粥樣硬化病變形成。ApoE-/-對照組小鼠主動脈壁形成明顯動脈粥樣硬化斑塊，提示AS造模成功。普洱熟茶茶多糖組動脈粥樣硬化程度與ApoE-/-對照組相比明顯減輕，多為早期粥樣硬化。管壁可見輕度隆起和增厚、泡沫細胞聚集，病變程度較ApoE-/-對照組減輕，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.4 普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠血清APN及IL-6的影響 由表4可知，與ApoE-/-對照組相比，普洱熟茶茶多糖組血清APN含量較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示經(jīng)普洱熟茶TPS干預(yù)后，ApoE-/-小鼠APN含量升高。與ApoE-/-對照組相比，普洱熟茶茶多糖組血清IL-6含量較低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示經(jīng)普洱熟茶TPS干預(yù)后，ApoE-/-小鼠炎癥因子IL-6水平降低。

3 討論

TPS是從茶葉中提取的活性復(fù)合多糖的總稱，包括酸性多糖、中性多糖、雜多糖和糖蛋白復(fù)合物等[9-11]。普洱熟茶屬于后發(fā)酵茶，加工中的渥堆工序存在濕熱作用和微生物酶解，許多化學成分大幅度下降，而水溶性茶多糖卻大量增加了近5倍。研究顯示，發(fā)酵茶類（烏龍茶、紅茶、普洱熟茶等）茶多糖分子量低于未發(fā)酵茶類，提示發(fā)酵作用可改變茶多糖理化特性，提高茶多糖的含量和活性[12-14]。因而，普洱熟茶TPS的開發(fā)利用具有廣闊的前景。

AS病理過程不僅與血脂代謝異常密切相關(guān)，還與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。高水平TC能致AS；而TG能加速AS和血栓形成的進程；LDL是血漿中主要帶膽固醇的脂蛋白，可被丙二醛等脂質(zhì)過氧化物氧化，被巨噬細胞上的消除受體攝取，并誘發(fā)泡沫細胞的形成，導(dǎo)致AS。實驗結(jié)果顯示，普洱熟茶TPS有調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠血脂的作用，血清TG、TC以及LDL-C降低，HDL-C升高，從而起到抗AS的作用。APN是由脂肪細胞分泌的細胞因子，通過與其受體結(jié)合，調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、保護血管和抗AS等。IL-6 是一種主要由活化的巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞等分泌的細胞因子，是介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的重要細胞因子[15-16]。ApoE-/-小鼠可形成AS幾乎所有階段的病變，并與人類的病變非常相似，是研究AS發(fā)病機理和干預(yù)措施較理想的動物，故本實驗采用 ApoE-/-小鼠作為實驗組動物，同品系C57BL/6J小鼠（ApoE+/+）作為陰性對照組，考察普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠AS的作用。實驗結(jié)果顯示，茶多糖組與ApoE-/-對照組相比，APN水平則顯著升高、IL-6水平顯著降低，從病理形態(tài)學上分析，茶多糖組主動脈粥樣硬化損傷程度亦比ApoE-/-對照組減輕。提示給予普洱熟茶TPS 12周后，ApoE-/-小鼠炎癥介質(zhì)水平降低，炎癥程度減輕，抗AS作用可能與其提高脂聯(lián)素水平從而抑制炎癥因子IL-6等生成有關(guān)。

綜上所述，普洱熟茶TPS可能通過調(diào)節(jié)血脂紊亂，抑制炎癥反應(yīng)來減緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進程，我們的研究可為普洱熟茶TPS抗AS的開發(fā)利用提供新的思路。

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（收稿日期：2018-03-07 編輯：劉 斌）