金蛭方對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠血清及腦組織IL—1β、TNF—α的影響

吳翟 王彩榮 張靈敏 楊建新 周恒 王麗

【摘 要】 目的：通過(guò)觀察金蛭方對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，探討其治療缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制。方法：采用線栓法復(fù)制缺血性中風(fēng)大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、金蛭方高劑量組、金蛭方低劑量組、陽(yáng)性藥尼莫地平片對(duì)照組。測(cè)定大鼠血清和腦組織IL-1β、TNF-α的含量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，缺血性中風(fēng)大鼠血清及腦組織IL-1β、TNF-α的含量均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各治療組均能降低IL-1β、TNF-α的含量（P<0.01）。結(jié)論：金蛭方通過(guò)調(diào)節(jié)缺血性中風(fēng)大鼠IL-1β、TNF-α的分泌和釋放以達(dá)到拮抗缺血性中風(fēng)作用。

【關(guān)鍵詞】 金蛭方；缺血性中風(fēng)；白介素-1β；腫瘤壞死因子-α

【中圖分類號(hào)】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）02-0042-03

Abstract：Objective To explore the effects of the Jinzhif，Prescription on ischemic stroke rat interleukin - 1 beta （IL-1）， the effect of the expression of tumor necrosis factor alpha （TNF alpha）， and to explore its mechanism in the treatment of ischemic stroke. Methods Using the suture method to copy the rat model of ischemic stroke were randomly divided into sham operation group， model control group， the Jinzhi Prescription high dose group， the Jinzhi Prescription low dose group， positive drug nimodipine tablets in the control group. The contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats were determined. Results Compared with sham operation group， the contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats with ischemic stroke were significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the treatment group could decrease the content of IL-1 and TNFα- （P<0.01）. Conclusion The Jinzhi Prescription through regulation of ischemic stroke rat IL-1， TNF -α secretion and release in order to achieve the antagonistic effect of ischemic apoplexy.

Keywords：Jinzhi Prescription； Lschemic Stroke； Interleukin 1 Beta； Tumor Necrosis Factor Alpha

金蛭方系課題組經(jīng)過(guò)多年篩選出的治療缺血性中風(fēng)的效方，臨床應(yīng)用10余年，但其治療作用機(jī)制尚不十分明確。腦缺血后發(fā)生腦損害的機(jī)制復(fù)雜，炎性反應(yīng)是缺血性腦損害的主要機(jī)制之一[1]。在參與炎癥反應(yīng)的眾多因子中，最有影響的是IL-lβ和TNF-α[2]。但中藥對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠IL-1β、TNF-α水平變化影響的報(bào)道相對(duì)較少。研究旨在通過(guò)觀察金蛭方對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠血清及腦組織IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響，探討其治療缺血性中風(fēng)的部分作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級(jí)，體重250～300g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：1119069。

1.2 藥物與試劑 金蛭方組成：水蛭、郁金、川芎、冰片（由遷安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備），上4味除冰片外水提濃縮成高、低劑量后加入相應(yīng)研磨冰片，所含生藥分別為：0.30g/mL（高劑量）、0.15g/mL（低劑量）。尼莫地平片（國(guó)藥準(zhǔn)字：H41022175，規(guī)格：20mg/片，鄭州瑞康制藥有限公司），按體重0.001g/mL配制成水溶液。IL-1β放射免疫分析試劑盒、TNF-α放射免疫分析試劑盒均由解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免研究所提供。

1.3 儀器 FJ-2020型γ射線免疫計(jì)數(shù)器（國(guó)營(yíng)262廠）；MSE-25型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LAUDA-C3型循環(huán)恒溫水浴箱（泰克儀器有限公司）；F6/10型超細(xì)勻漿機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司） 。

1.4 造模方法 參考改良的Longa法[3]：頸部正中切口，用3-0手術(shù)絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈（ECA）遠(yuǎn)端及枕動(dòng)脈，在結(jié)扎線距分叉部2mm處剪斷ECA，將一端已加工成光滑球形的尼龍線從ECA殘端插入進(jìn)行結(jié)扎，將尼龍線經(jīng)頸總動(dòng)脈（CCA）[JP+1]分叉部插入頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），此時(shí)松開(kāi)CCA，ICA套線恢復(fù)血流，線栓推送順滑，無(wú)出血。將線栓向上深入至分叉以上18～19mm達(dá)到大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，將頸總動(dòng)脈連同尼龍線一起結(jié)扎，縫合切口后外留尼龍線0.5cm，放到單籠中，2h后外拉尼龍線使其球端回至ECA進(jìn)行缺血后再灌注。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥[4] 60只大鼠自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)于18～22℃明暗各12h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組。假手術(shù)組：手術(shù)時(shí)僅作頸部手術(shù)切口，鈍性分離頸前肌，游離暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，術(shù)后當(dāng)日灌服蒸餾水。模型對(duì)照組（簡(jiǎn)稱模型組）：造模當(dāng)日灌服蒸餾水。金蛭方低劑量組（簡(jiǎn)稱低劑量組）：造模當(dāng)日灌服金蛭方，每日用藥劑量為1.5 g/kg（相當(dāng)于成人劑量的10倍）。金蛭方高劑量組（簡(jiǎn)稱高劑量組）：術(shù)后當(dāng)日灌服金蛭方，每日用藥劑量為3.0 g/kg （相當(dāng)于成人劑量的20倍）。陽(yáng)性藥尼莫地平片對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組）：術(shù)后當(dāng)日灌服尼莫地平片，每日用藥劑量為0.01 g/kg （相當(dāng)于成人劑量的20倍）。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1mL/100g計(jì)算，連續(xù)給藥2周。

1.6 檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)2周末，最后1次給藥禁食12h后，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，注入離心管中待凝固后，4℃ 3000 r/min離心10 min，[JP+1]分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。取血后，迅速斷頭冰浴中取右側(cè)大腦額葉皮層同一位置取腦組織100 g，濾紙吸干血跡，盡快加入預(yù)冷的生理鹽水碾磨，制成組織勻漿，4℃3000 r/min離心，15 min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。放免法檢測(cè)血清及腦組織中TNF- α、IL-1β的含量，具體操作嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，多組間比較用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著升高；經(jīng)用藥干預(yù)后，各治療組均能降低大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達(dá) （P<0.01）；其中，高劑量組較低劑量組和對(duì)照組大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達(dá)降低（P<0.05），低劑量與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

課題組通過(guò)對(duì)中風(fēng)病臨床癥候?qū)W研究，認(rèn)為缺血性中風(fēng)患者多是在氣血內(nèi)虛的基礎(chǔ)上，加之勞倦內(nèi)傷、憂思惱怒、嗜食厚味、煙酒等誘因，導(dǎo)致氣血逆亂，直沖犯腦，致氣血瘀滯，腦脈痹阻。氣滯、血瘀、絡(luò)阻為本病的主要病機(jī)，“氣行則血行”，行氣、活血、通絡(luò)為其有效治則組成金蛭方，研制院內(nèi)制劑“金蛭膠囊”（制劑號(hào)：冀藥制字Z20051013），治療缺血性中風(fēng)10余年，療效滿意。方中水蛭破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)，《本草匯言》曰：“水蛭逐惡血、散瘀血之要藥也”；郁金行氣活血，化痰降火，《本草匯言》曰：郁金其性清揚(yáng)，能散郁滯，順逆氣，上達(dá)高巔，善行下焦；川芎行氣活血，歷代醫(yī)家認(rèn)為其：“善治中風(fēng)，治風(fēng)圣藥”[5]；冰片醒神通竅，《本草衍義》曰：“芳香走竄，引藥上行，獨(dú)行則勢(shì)弱，佐使則有功”，四藥合用，共奏活血、化瘀、通絡(luò)之功。

IL-lβ是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)細(xì)胞因子之一，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)的不同而有2種類型：IL-Iα和IL-1β，兩者的基因結(jié)構(gòu)上有20%～30%的同源性，在許多系統(tǒng)中作用相似，但在腦內(nèi)以IL-lβ的作用為主。IL-1β在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦對(duì)各種損傷的反應(yīng)中有重要的作用[6]。IL-1β的生物學(xué)作用包括刺激其它細(xì)胞因子和可溶性損傷介質(zhì)的合成、誘導(dǎo)白細(xì)胞浸潤(rùn)、影響膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)等。研究表明，IL-1β可能參與缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元死亡，在缺血性病理?yè)p傷中起重要作用[7]。

Carswell等在給接種過(guò)卡介苗的小鼠注射脂多糖（LPs）后發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中出現(xiàn)一種能引起腫瘤出血性壞死的物質(zhì)，并將其命名為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）。TNF分為T(mén)NF-a和TNF-β。TNF-a為一種細(xì)胞分泌的蛋白，屬于一種前炎癥細(xì)胞因子[8]，在觸發(fā)炎癥反應(yīng)中處于中心地位，與IL-1、IL-6和生長(zhǎng)因子共同啟動(dòng)，調(diào)節(jié)大腦局部炎癥反應(yīng)[9]。

研究表明，采用線栓法復(fù)制的缺血性中風(fēng)大鼠模型血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α表達(dá)升高，說(shuō)明IL-1β和TNF-α參與了缺血性中風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展。經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組可降低大鼠血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α表達(dá)，表明金蛭方能調(diào)節(jié)IL-1β和TNF-α分泌和釋放，以達(dá)到減輕腦缺血炎癥、改善神經(jīng)功能、預(yù)防和治療缺血性中風(fēng)的作用，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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