響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總氨基酸的提取工藝研究

蘭慧 陽(yáng)敬

【摘 要】 目的：優(yōu)化白刺花中總氨基酸的最佳提取工藝。方法：采用響應(yīng)面分析法，以總氨基酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在考察單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、加液量、提取溫度和提取時(shí)間為自變量，利用Design-Expert軟件分析優(yōu)化出白刺花中總氨基酸的最佳提取工藝條件。結(jié)果：優(yōu)化所得白刺花中總氨基酸的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為58%，加液量為21倍，提取溫度為69℃，提取時(shí)間為131 min。結(jié)論：響應(yīng)面優(yōu)化所得到的最佳提取工藝準(zhǔn)確、穩(wěn)定，是提取白刺花中總氨基酸的可行方法。

【關(guān)鍵詞】 白刺花；總氨基酸；提取工藝；響應(yīng)面法

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）13-0018-07

Abstract：Objective Optimize the extraction technology of total amino acid from Sophora viciifolia hance.Methods Response surface models was used to optimize the extraction technology of total amino acid from Sophora viciifolia hance.The total amino acid were extracted using ultrasonic assisted ethanol extraction.On the basis of single factor， the concentration of ethanol， the amount of liquid added， the extraction temperature and the extraction time were the independentvariables.Design-Expert response surface methodology was employed for selecting the optimum extraction process by the indexes of the contents of total amino acid from Sophora viciifolia hance.Results Total amino acid from Sophora viciifolia hance of optimum extraction conditions were as follows，58% of the ethanol concentration，21 times of the amount of liquid added，extraction temperature of 69℃，extraction time 131min. Conclusion The extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable，accurate and reliable. It was a feasible method to extract the total amino acid from Sophora viciifolia hance.

Keywords：Sophora Viciifolia Hance；Total Amino Acid；Extraction Process；Response Surface Methodology

白刺花又名苦豆花、狼牙刺，在南方各地均有大量分布[1]，其花為漢族民間及少數(shù)民族習(xí)用，在民間有廣泛的用藥基礎(chǔ)和豐富的藥物資源[2]，同時(shí)也是藥食兩用之品[3]。白刺花有清熱利咽、涼血消腫等作用，主治咽喉腫痛、便血、肺熱咳嗽、痢疾、淋證、水腫、衄血、尿血等；花有清熱解暑作用，用于暑熱煩渴作用[4]。此外白刺花還含有大量的營(yíng)養(yǎng)成分，如多種氨基酸等[5]。基于白刺花良好的藥食兩用用價(jià)值，筆者欲將野生白刺花開發(fā)成為保健速溶茶，現(xiàn)通過實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)化出白刺花中總氨基酸的最佳提取方法，為白刺花保健速溶茶的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 A580型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（翱藝儀器有限公司）；ML204分析天平（上海亞榮儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；HH-4 型恒溫水浴鍋（常州潤(rùn)華電器有限公司）；DLF-18型流水式中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；RE-3000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮儀器有限公司）。

1.2 材料 甘氨酸對(duì)照品（分析純，批號(hào)：130518，中國(guó)新型化工試劑研究所）；苯駢戊三酮（茚三酮，分析純，批號(hào)：20110414）；磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8，實(shí)驗(yàn)室配制）；白刺花采自紅河州豆科小灌木植物白刺花的花；所用到的其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 茚三酮溶液的制備 精密稱取茚三酮約0.5g 置于25 mL 量瓶中，加適量無水乙醇溶解后定容成2%的茚三酮溶液，冰箱冷藏備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備[6-7] 精密稱取干燥至恒重的甘氨酸對(duì)照品5.000 mg置于50 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解后，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升標(biāo)準(zhǔn)品溶液含甘氨酸0.1 mg）。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇[8] 精密量取對(duì)照品溶液2 mL，置10 mL 量瓶中，加入茚三酮溶液1 mL，再加入磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）2 mL，搖勻，水浴鍋上加熱15 min，冷卻，用蒸餾水稀釋至刻度，以空白試劑作參照，于波長(zhǎng)400～600 nm范圍內(nèi)掃描，569 nm波長(zhǎng)處有一最大吸收峰，故選擇569 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取對(duì)照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 于 10 mL 量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后，選擇569 nm波長(zhǎng)，用空白試劑做參照，測(cè)定6種溶液的吸光度值。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程Y=76.243X-0.0041，R2=0.9998，對(duì)照品溶液濃度與吸光度在0.002～0.012 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 供試品溶液的制備 將白刺花原料粉碎，過60目篩，取粗粉過的白刺花5 g，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件進(jìn)行提取，提取液減壓抽濾，濾液定容至100 ml，即得供試品溶液。

2.1.6 樣品中總氨基酸的含量測(cè)定 精密量取2 ml供試品溶液置于10 ml容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總氨基酸提取率。

總氨基酸的提取率（%）=C×V1×V3×100V2×m

式中：C 為提取總氨基酸的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為測(cè)量液定容體積，10 mL；V2為測(cè)量時(shí)量取的體積，2 mL；V3為提取液定容體積，100mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，5000 mg。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 分別精密移取對(duì)照品溶液2mL和供試品溶液2 mL，分別于569 nm波長(zhǎng)處以空白溶劑為對(duì)照，按2.1.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光度（n=6），結(jié)果對(duì)照品溶液吸光度的RSD=0.16% ，供試品溶液的RSD=0.23%，表明該試驗(yàn)方法精密度良好 。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取供試品溶液2 mL，按“2.1.3”項(xiàng)方法，分別于 0、30、60、90、120、150、180測(cè)定吸光度，結(jié)果樣品溶液顯色后180min內(nèi)吸光度的RSD=1.37% ，表明供試品溶液顯色穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密移取該供試品溶液2 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液的吸光度（n=6），并計(jì)算出各供試品溶液中總氨基酸的含量，其RSD=0.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的白刺花藥材粗粉5 g，精密稱定，平行 6份，按2.1.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取各供試品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，在各容量瓶中分別加入1、2、3、4、5、6 mL的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶度為0.1 mg/mL），按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液的吸光度，計(jì)算各供試品溶液中總氨基酸的含量，并計(jì)算各供試品溶液中總氨基酸的回收率，結(jié)果平均回收率為99.91%，RSD=0.72%，表明該試驗(yàn)方法回收率良好。

2.3 單因素考察

2.3.1 加液量對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)的乙醇濃度為60% ，時(shí)間為1.5h（90min），溫度為80℃ 等試驗(yàn)因素，考察加液量為5倍、10倍、15倍、20倍、25倍情況下所提取的總氨基酸的變化。由圖2得知，白刺花中總氨基酸的提取率隨加液量倍數(shù)的增大而增高，但加液量為20倍與加液量25倍比較，總氨基酸的提取率雖然有所提高，但提高值不大，從生產(chǎn)角度出發(fā)，加液量到25倍，意義不大。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)的加液量為20倍，乙醇濃度為 60% ，溫度為 80 ℃等試驗(yàn)因素，考察時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h情況下所提取的總氨基酸的變化。由圖3得知，白刺花中總氨基酸的提取率在提取時(shí)間為2 h時(shí)最高，此時(shí)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率反而下降，故提取時(shí)間為2h時(shí)對(duì)白刺花中總氨基酸的提取較為理想。圖中也可反應(yīng)出提取時(shí)間過長(zhǎng)，白刺花中氨基酸成分會(huì)被破壞。

2.3.3 乙醇濃度對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)的加液量為20倍，時(shí)間為2 h，溫度為80 ℃，考察乙醇濃度分別為40%乙醇 、50%乙醇 、60%乙醇 、70%乙醇 、80%乙醇情況下所提取的總氨基酸的變化。從圖4得知，在乙醇濃度為60%以后，總氨基酸的提取率在呈下降趨勢(shì)，即當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總氨基酸的提取率達(dá)到最高。

2.3.4 提取溫度對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)加液量為20倍，時(shí)間2 h，乙醇濃度為60%，考查溫度分別為40、50、60、70、80、90℃情況下所提取的總氨基酸的變化。從圖5得知，隨著溫度升高，白刺花中氨基酸提取率在增高，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃ 時(shí)，白刺花中總氨基酸提取率達(dá)到最高。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總氨基酸提取工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度（A）、加液量（B）、提取溫度（C） 和提取時(shí)間（D）為考察因素，利用 Design-Expert8.0.6軟件中的 Box-Behnken 軟件對(duì)白刺花中總氨基酸提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以白刺花總氨基酸提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)[9-10]，以乙醇濃度（A）、加液量（B）、提取溫度 （C） 和提取時(shí)間 （D）為自變量，以總氨基酸提取率為響應(yīng)值（Y） 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平設(shè)計(jì)見表2。白刺花Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

采用Design-Expert8.0.6軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，以總氨基酸的提取率為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得回歸方程為：Y=0.62-0.011A+0.010B-0.013C+0.033D-4.500E-003AB-6.000E-003AC-0.016AD+0.013BC+0.012BD-5.000E-004CD-0.041A2-0.031B2-0.040C2-0.055D2

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)方程及各因子進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表4。由表4可知，以白刺花的總氨基酸的提取率為響應(yīng)值，回歸方程顯著性檢測(cè) P﹤0.0001，表明所得二次方程模型極顯著，而失擬項(xiàng)的P值為0.2445，不顯著，R2=0.9713，表明回歸方程模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合性比較好，試驗(yàn)誤差較小，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總氨基酸提取工藝是可行的，具有參考性[11]，其中各影響因素對(duì)白刺花總氨基酸提取率的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>提取溫度>乙醇濃度>加液量。