正交試驗(yàn)法優(yōu)化芹菜葉中綠原酸的提取工藝

尚朝利 夏小婧

【摘 要】 目的：優(yōu)化芹菜葉中綠原酸的提取工藝。方法：采用超聲波法對(duì)芹菜葉中綠原酸進(jìn)行提取，并進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，以綠原酸的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定含量。結(jié)果：在功率300 W條件下，超聲40 min，用10倍量的75%乙醇作為溶媒提取3次為最佳工藝條件。結(jié)論：采用超聲提取工藝，能提高芹菜葉中綠原酸的提取效率，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，操作穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】 超聲波提取；芹菜；綠原酸；正交實(shí)驗(yàn)

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）06-0025-03

芹菜為傘形科多年生草本植物芹菜（Apium graveolens L.）的帶根全草，味甘、辛、微苦，性涼[1]?！侗静菥V目》記載：“旱芹，其性滑利”。芹菜在我國(guó)已有2000年的種植歷史，培育出了旱芹、水芹、西芹等多個(gè)亞種，其中以旱芹的藥用功效最好，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用的中藥材，具有安神、利尿消腫、平肝降壓、養(yǎng)血補(bǔ)虛、清熱解毒、防癌抗癌、醒酒養(yǎng)胃等藥用功效，同時(shí)還具有減肥、美白的功效[1]。目前從金銀花、菊花、杜仲葉、山楂等中提取綠原酸的方法已有報(bào)道[2-5]，但是從芹菜中的提取分離綠原酸尚未見(jiàn)有報(bào)道。超聲波輔助提取的方法，有利于提高溶劑提取法的效率，縮短提取時(shí)間，減少溶劑用量，節(jié)能環(huán)保等[6]。筆者研究芹菜葉中綠原酸的提取工藝，以期為芹菜的綜合開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 GVT-15L功率可調(diào)式超聲波清洗機(jī)（深圳市夠威科技有限公司）；LC-20AB高效液相色譜儀（含SPD-M20A PDA紫外檢測(cè)器，日本島津）。

1.2 材料 綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度：>98.0%），芹菜葉（購(gòu)于信陽(yáng)市浉河區(qū)化工路丹尼斯，經(jīng)信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院吳長(zhǎng)忠副教授鑒定為傘形科草本植物芹菜（Apium graveolens L.）的葉，60 ℃減壓干燥至恒重）。甲醇（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），乙醇（分析純，鄭州晟弘工貿(mào)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸的含量測(cè)定

2.1.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 以甲醇為空白對(duì)照，用30μg/mL的綠原酸對(duì)照品甲醇溶液，在200～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸在328 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道，芹菜中綠原酸的含量相對(duì)較低，為了提高檢測(cè)的靈敏度，選擇在綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其含量。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Luna C18 ODS柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。按照上述條件各組分分離度良好。采用外標(biāo)法測(cè)定綠原酸的含量。

2.1.3 方法學(xué)驗(yàn)證 根據(jù)文獻(xiàn)[7-9]的實(shí)驗(yàn)方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線、驗(yàn)證回收率、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等，進(jìn)行方法學(xué)考察。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=1.2×105X+8152.3（r=0.9998），說(shuō)明進(jìn)樣量在0.01～1.00 μg范圍內(nèi)與峰面積成良好的線形關(guān)系；加樣回收率分別為98.91%、99.42%、99.13%，RSD分別為1.92%、1.86%、1.75% （n=3），表明該方法準(zhǔn)確定良好；連續(xù)進(jìn)樣6次，綠原酸峰面積的RSD為0.48%（<3%），說(shuō)明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)說(shuō)明24 h內(nèi)綠原酸供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2 提取溶劑的選擇 綠原酸可溶于熱水，易溶于乙醇和丙酮?？紤]到成本和毒性的原因，選用純化水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇作為溶劑，按照“2.4.2 制備工藝”項(xiàng)下方法，進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察溶劑對(duì)綠原酸提取的影響，并按“2.1含量測(cè)定”項(xiàng)下的方法，測(cè)定提取液中綠原酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

由上表可知，以75%乙醇作為提取溶劑時(shí)，綠原酸的提取率比較高，因此采用75%乙醇作為提取溶劑。

2.3 提取次數(shù)的選擇 選用75%乙醇作為提取溶劑，按照“2.4.2 制備工藝”項(xiàng)下方法，進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察提取次數(shù)對(duì)綠原酸的累積提取量的影響，并按“2.1含量測(cè)定”項(xiàng)下的方法，測(cè)定提取液中綠原酸的含量。結(jié)果見(jiàn)圖1。

由上圖可知，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，累積提取量的增加已經(jīng)非常緩慢，而且第3次的累積提取量已經(jīng)達(dá)到六次的總累積提取量的97.3%。因此，為了簡(jiǎn)化濃縮等后處理的需要，選用提取3次。

2.4 超聲波樣品提取液的制備

2.4.1 工藝設(shè)計(jì) 選用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，參考有關(guān)文獻(xiàn)，選取表2中四個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.4.2 制備工藝 取干燥至恒重的芹菜葉10.0 g精密稱定，用提取溶劑浸泡30 min超聲提取3次，合并提取液，濾過(guò)，濃縮，用甲醇稀釋到適宜的濃度，得到超聲樣品[5-6]。

2.5 樣品含量測(cè)定 將L9（34）正交試驗(yàn)的提取液按“2.1項(xiàng)下含量測(cè)定法”進(jìn)行測(cè)定。由表3、4可知，超聲波的功率和超聲提取的時(shí)間是影響超聲提取的主要因素（P<0.05），而其他兩個(gè)因素的影響較小。最佳方案的為：A1B3C2D3，即在功率300 W條件下，超聲40 min，用10倍的用量的75%乙醇作為溶媒提取3次為最佳工藝條件。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 采用優(yōu)化后的超聲提取法，提取芹菜葉中的綠原酸。提取結(jié)果為1.43 mg/g、1.39 mg/g、1.42 mg/g、1.41 mg/g、1.45 mg/g和1.38 mg/g，RSD為1.83%。由此可知，優(yōu)化后的超聲提取法提取芹菜葉中的綠原酸，提取效率高，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，操作穩(wěn)定性好。

3 討論

綠原酸是植物的次生代謝產(chǎn)物之一，具抗氧化、抗菌、抗病毒、保肝利膽、解痙和抗誘變等多種藥理活性[10]。由于綠原酸分子內(nèi)含有鄰二酚羥基和雙鍵等易氧化的基團(tuán)，并含有酯鍵等易水解的基團(tuán)，導(dǎo)致其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，具有還原性，易被氧化，同時(shí)也不耐高溫，高溫時(shí)容易分解失效。因此本實(shí)驗(yàn)采用可以密閉提取的超聲波提取法，以提高綠原酸的提取率，減少提取過(guò)程中溫度和氧氣對(duì)綠原酸的破壞作用。

芹菜葉主要含有蛋白質(zhì)、纖維素、碳水化合物、維生素、微量元素等對(duì)人體有益的物質(zhì)，同時(shí)還含有黃酮、多糖、綠原酸等具有藥理活性的化合物，具有降壓、消腫、抗癌、安神、止血、健胃和補(bǔ)虛等臨床應(yīng)用。本研究為芹菜在食品和藥品領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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