細(xì)葉結(jié)縷草褐斑病病原菌的分離、鑒定及殺菌劑 室內(nèi)毒力測定

章 武，牛學(xué)禮,劉金祥,黃俊文，林金梅，黎宇婷

(1.嶺南師范學(xué)院，廣東 湛江 524048； 2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631)

草坪不僅在保護(hù)和美化環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用，也是人們休閑、娛樂和進(jìn)行體育鍛煉的重要活動場所。隨著人類社會與經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，高質(zhì)量的草坪已成為現(xiàn)代化建設(shè)中必不可少的重要組成部分[1]。然而，草坪草在遭受一些病害侵染后會發(fā)生早衰甚至死亡，這不僅直接影響了草坪的觀賞價值，還降低了其應(yīng)用價值，給草坪產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。加之草坪和綠地面積的不斷擴(kuò)大以及草坪的集約化管理程度逐漸提高，我國大量引進(jìn)國外草坪草種子，導(dǎo)致草坪病害的發(fā)展也越來越嚴(yán)重，致使草坪使用年限減少，甚至衰敗廢棄[2]。

我國草坪業(yè)自20世紀(jì)80年代以來有了迅猛的發(fā)展，草坪工作者對我國各地草坪病害進(jìn)行了詳細(xì)的調(diào)查與鑒定[3-6]。翁啟勇[7]整理了16類國內(nèi)外已報道的結(jié)縷草屬的真菌病害，病原隸屬21個屬，近30個種。劉曉妹等[8]報道了海南省結(jié)縷草病害有褐斑病(Rhizoctoniasolani)、白絹病(Sclerotiumrolfsii)、離孺孢葉枯及根腐病(Bipolariscynodontis)、彎孢霉葉枯病(Curvularialunata)、銹病(Pucciniazoysiae)、德氏霉葉枯病(Drechsleraspp.)、喙孢霉云紋病(Rhynchosporiumsecalis)、黑孢霉葉斑病(Nigrosporasphaeri)、梨孢灰斑病(Pyriculariagrisea)和炭疽病(Colletotrichumgraminicola)共10種病害。翁啟勇等[9]發(fā)現(xiàn)福建省的結(jié)縷草銹病發(fā)生比較普遍。國外方面，Smiley 等[10]詳細(xì)介紹了世界范圍內(nèi)的草坪草病害，其中記錄的結(jié)縷草病害與翁啟勇整理的病害種類基本一致。

細(xì)葉結(jié)縷草(Zoysiatenuifolia)又名天鵝絨草，臺灣草，是結(jié)縷草屬禾本科草坪草種。其草莖葉纖細(xì)美觀，形成的草坪低矮平整，再加上侵占力極強(qiáng)，能在鋪設(shè)草皮后較短時間內(nèi)快速成坪[11]。所以該暖季型草坪草種被普遍應(yīng)用于我國華南地區(qū)的公園，住宅小區(qū)和庭院等區(qū)域供人觀賞。又因其抗逆性和耐踐踏能力強(qiáng)，故也可做運動和各種娛樂休閑活動的場地。

對海南和廣東省多個地區(qū)的細(xì)葉結(jié)縷草草坪草病害進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一種病害對細(xì)葉結(jié)縷草危害嚴(yán)重，染病草坪上常出現(xiàn)圓形如眼圈狀或者不規(guī)則形狀的褐色枯草斑，直徑為1～2 m，有些大型病斑可達(dá)3 m。由于該病害分布較廣，并極大的影響了細(xì)葉結(jié)縷草草坪的應(yīng)用和觀賞價值，因此，急需明確該病害的病原及探索合理化學(xué)防治方法，通過對草坪草染病草坪病原菌進(jìn)行分離、鑒定，并在室內(nèi)測定了殺菌劑對病原菌的毒力，以期科學(xué)鑒定與有效防治該草坪草病害。

1 材料和方法

1.1 病害調(diào)查與標(biāo)本采集

2014～2016年，對我國海南省海口市、三亞市、萬寧市、瓊海市、文昌市和廣東省廣州市、深圳市、湛江市8個城市中15處由細(xì)葉結(jié)縷草建植的草坪綠地進(jìn)行了病害調(diào)查。在調(diào)查過程中，各地均發(fā)現(xiàn)了癥狀相似的細(xì)葉結(jié)縷草病害，記錄發(fā)病癥狀后，用像機(jī)拍攝田間危害癥狀，每個區(qū)域均采發(fā)病葉片裝入保鮮袋，同時記錄采集地點后，帶回實驗室保存于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 病原菌的分離

選擇發(fā)病癥狀明顯的葉片，用無菌水沖洗干凈后，采用常規(guī)植物病理組織分離法，在病斑與健康葉片處剪下5 mm2的小塊組織，放入2%的次氯酸鈉溶液中消毒1 min，接著用無菌水沖洗3次，置于超凈工作臺中晾干后放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA) 培養(yǎng)基上，常溫下培養(yǎng)。待菌絲從葉片邊緣長出后，用接種針切取2～3 mm 菌絲段于新的含有PDA的培養(yǎng)皿中進(jìn)行純化培養(yǎng)。病原菌純化后，將其保存于PDA斜面培養(yǎng)基試管中，并放置于4℃冰箱內(nèi)備用。隨機(jī)選取分離自海南省?？谑胁≡闔D-RS1用于進(jìn)一步研究。

1.3 病原菌的形態(tài)鑒定

將分離獲得的病原菌菌株HD-RS1活化培養(yǎng)后，持續(xù)觀察其菌落形態(tài)并拍照。在微生物顯微鏡下觀察病原菌的菌絲形態(tài)特征，記錄其微觀形態(tài)特征，并拍攝照片，測量其大小，測量50次。查閱相關(guān)專著文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定。

1.4 病原菌分子鑒定

將菌株HD-RS1在PDA培養(yǎng)基上活化后于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周，用無菌玻璃薄片將菌絲刮下，并置于液氮中充分研磨。參照van Burik等[12]的CTAB法對病原菌基因組DNA進(jìn)行提取，并將提取的DNA保存于-20℃冰箱內(nèi)。利用White等[13]設(shè)計的rDNA-ITS區(qū)域通用引物ITS-1和ITS-4 (上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)，以病原菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期產(chǎn)物約700 bp。PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCR MasterMix 25 μL(Takara，大連，中國)，20 μmol/L引物各1 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min。將所得PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖中電泳，并在凝膠成像儀上檢測。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司對PCR產(chǎn)物進(jìn)行存化并測序。將測得的ITS序列提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中獲得GenBank登錄號，同時用數(shù)據(jù)庫中的Blastn軟件進(jìn)行比對和同源性分析，并下載相似度高的Rhizoctonia屬中同為草坪草病原菌相關(guān)序列。利用Mega 7.0中的Clustal X功能對序列進(jìn)行比對，然后采用鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，樹中節(jié)點的自舉置信度水平由自展值( Bootstrap value) 估計，重復(fù)次數(shù)為1 000。最后將分析結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對病原菌進(jìn)行鑒定。

1.5 致病性測定

將田間土壤和細(xì)沙按1∶1體積混勻滅菌后，分裝在10 cm×10 cm塑料花盆中，將細(xì)葉結(jié)縷草種子(購于北京克勞沃集團(tuán)) 按密度為0.5 mg/cm2播種于土壤中，播深為1 cm，每天澆無菌水50 mL以確保土壤濕潤。播種后，每盆施用0.5 g顆粒肥(海豐，安徽，中國)，播種1周，種子開始萌發(fā)并出苗，3周后進(jìn)行修剪，每個星期修剪一次，保留草坪草高度約5 cm，在溫室中培養(yǎng)6周后備用。將菌株HD-RS1在新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，用滅菌后的打孔器在菌落邊緣處打取直徑約為5 mm的菌絲塊，將長有菌絲的一面蓋于植株葉片上，每盆栽接種10個菌塊，以接種無菌PDA菌餅作為對照。每個處理接種5盆細(xì)葉結(jié)縷草，作為5個重復(fù)。接種后，盆栽套袋保濕48 h，將其放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，持續(xù)觀察發(fā)病情況一周。

1.6 殺菌劑對病原菌室內(nèi)毒力測定

供試殺菌劑為田間常用于防治草坪草病害的9種殺菌劑，分別為1)70%代森錳鋅可濕性粉劑，四川國光農(nóng)化有限公司；2)70%甲基托布津可濕性粉劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司；3)75%百菌清可濕性粉劑，利民化工股份有限公司；4)50%多菌靈可濕性粉劑，四川國光農(nóng)化有限公司；5)20%三唑酮乳油，四川國光農(nóng)化有限公司；6)43%戊唑醇懸浮劑，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；7)12.5%腈菌唑乳油，華北制藥集團(tuán)愛諾制藥有限公司；8)50%異菌脲懸浮劑，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；9)12.5%烯唑醇可濕性粉劑，上海愛幫農(nóng)科技有限責(zé)任公司。

采用菌絲生長速率法測定殺菌劑對病原菌的毒力大小。在培養(yǎng)了4 d的生長狀況良好的菌落邊緣打取菌餅并移至預(yù)先配制好的濃度為0、0.1、1.0 10.0和100.0 mg/L的各殺菌劑的PDA培養(yǎng)基上，在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長情況，然后測量菌落直徑，計算相對抑菌率。根據(jù)菌株在不同濃度殺菌劑的抑菌率大小，設(shè)置各殺菌劑的濃度梯度用于毒力的測定，每種殺菌劑均設(shè)5個濃度梯度(表2)，每皿為1個重復(fù)，每個濃度4個重復(fù)，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后測量菌落直徑，計算各菌落的凈生長量和相對抑菌率，并對殺菌劑濃度的對數(shù)值(x)和相對抑菌率的概率值(y)進(jìn)行擬合，得出擬合方程，計算得到相關(guān)系數(shù)和EC50值。

凈生長量(mm)=菌落直徑(mm)-菌餅直徑(mm)

相對抑制率=[(對照凈生長量-處理凈生長量)/對照凈生長量]×100%

表1 殺菌劑的毒力測定濃度梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)葉結(jié)縷草褐斑病癥狀

在調(diào)查的海南省和廣東省8個城市的15處草坪綠地中均發(fā)現(xiàn)褐色斑為害細(xì)葉結(jié)縷草，且危害嚴(yán)重。其發(fā)病的典型特征是草坪呈現(xiàn)出褐色的大型枯草斑或形成蛙眼狀環(huán)形病斑或不規(guī)則形狀的大塊斑塊(圖1A,B)。染病單個植株通常被蛛絲狀菌絲纏繞，葉片首先呈現(xiàn)水浸狀斑點，然后斑點逐步擴(kuò)大形成條形或梭行的病斑，病斑邊緣有明顯深褐色邊界，接著葉片變成灰白色，最終整個植株枯萎死亡(圖1C,D)。當(dāng)病害嚴(yán)重時，病害可迅速蔓延，枯萎植株形成可達(dá)2～3 m的枯草斑，有時枯草斑圈內(nèi)植株逐漸恢復(fù)，而病原菌仍逐步向外擴(kuò)張，因此，形成了蛙眼狀枯草斑。

圖1 細(xì)葉結(jié)縷草褐斑病癥狀Fig.1 The symptoms of brown patch on Zoysia tenuifolia

2.2 病原菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征

從15個細(xì)葉結(jié)縷草褐斑病病害葉片樣品中共分離獲得15株病原菌，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)各個病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征一致，隨機(jī)選取分離自海南省?？谑械牟≡闔D-RS1用于進(jìn)一步分析。病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，首先菌絲稀薄快速向外擴(kuò)延，2～3 d即可長滿全皿(90 mm)，菌絲灰白色至淡褐色，接著菌絲逐漸變厚，形成蓬松的氣生菌絲。培養(yǎng)一周后菌絲集結(jié)，菌落開始變得致密，部分氣生菌絲開始塌陷。隨著培養(yǎng)時間的增加，菌落表面逐漸由灰白色變?yōu)楹稚?，菌絲開始集結(jié)形成致密的深褐色菌核。隨著菌絲不斷集結(jié)，整個皿可形成一圈菌核(圖2A,B)。

圖2 立枯絲核菌在PDA上的培養(yǎng)性狀 (A 正面，B 反面)Fig.2 Colony morphology of Rhizoctonia solanion the PDA(A right，B reverse)

將菌絲放置于生物顯微鏡下觀察，可見菌絲粗壯，直徑7～12 μm，直角分枝，分枝處縊縮，附近形成隔膜。初生菌絲較細(xì)，老熟后常形成粗壯的念珠狀菌絲(圖3A,B)。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

對病原菌菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物純化后測序，獲得了710 bp的rDNA-ITS序列片段，與預(yù)期片段大小相符。將病原菌序列提交至NCBI網(wǎng)站獲得序列登錄號為：KR815446。利用NC BI網(wǎng)站中的BLAST軟件，對所測菌株的序列進(jìn)行同源性比對得知該菌株病原菌與立枯絲核R.solani(登錄號KU696484和KT362082) 的同源性均達(dá)到了100%。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，分離自海南省海口市的病原菌菌株HD-RS1與多R.solani菌株聚在一個分類單元，且其他的Rhizoctonia屬真菌菌株處在不同分支,自舉置信度高達(dá)100%(圖4)。

圖3 立枯絲核菌菌絲形態(tài)Fig.3 Mycelial morphology of Rhizoctonia solani

圖4 于細(xì)葉結(jié)縷草褐斑病病原菌菌株rDNA-ITS與相關(guān)真菌的系列比較而構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic relationships amongisolates of the pathogen of brown patchand related fungi of internal transcribed space(ITS)rDNA sequence

2.4 病原菌的致病性測定

將病原菌菌株HD-RS1接種細(xì)葉結(jié)縷草植株3 d后，葉片開始發(fā)病，發(fā)病初期病斑為淺黃色或淡綠色小斑點，后逐步擴(kuò)散為長橢圓形或梭行病斑，病斑周圍為黃褐色，接種5 d后，葉片大部分面積變褐枯黃，形成深褐色條狀病斑，葉片伴有萎蔫癥狀，可見褐色氣生菌絲覆蓋于葉片之上。接種7 d后，接種葉片均出現(xiàn)病癥，發(fā)病嚴(yán)重的葉片呈現(xiàn)枯萎狀。接種病原菌植株表現(xiàn)的癥狀與田間發(fā)病癥狀一致，并且可從病斑組織重新分離病原菌，完成科赫法則的驗證。

2.5 殺菌劑對病原菌的毒力

應(yīng)用生長速率測定法在PDA平板上測定9種殺菌劑對R.solani菌絲生長的抑制作用，結(jié)果表明，在供試的9種藥劑中5%烯唑醇、43%戊唑醇、20%三唑酮和12.5%腈菌唑?qū).solani的毒力較高，其EC50值分別為0.055、0.113、0.175和0.195 mg/L，其次是70%代森錳鋅和50%異菌脲，其EC50值為0.634和0.640 mg/L，毒力較低的是75%百菌清、50%多菌靈和70%甲基托布津，其EC50值分別為1.671，3.632和7.021 mg/L(表2)。

表2 9種殺菌劑對立枯絲核菌的毒力

3 討論

對海南和廣東省主要草坪建植草種之一的細(xì)葉結(jié)縷草病害進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了草坪褐斑病病害可嚴(yán)重危害兩省多處細(xì)葉結(jié)縷草草地。通過觀察病害的田間為害癥狀、病原菌形態(tài)、培養(yǎng)性狀、分子生物學(xué)特性和致病性測定并查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料[15-18]確定了導(dǎo)致細(xì)葉結(jié)縷草病害的病原為立枯絲核菌(R.solani)。該病害對華南地區(qū)細(xì)葉結(jié)縷草病害造成了較大危害，當(dāng)?shù)夭萜汗芾碚邞?yīng)引起足夠的重視，做好相應(yīng)的預(yù)防措施。

草坪褐斑病病原菌除立枯絲核菌(R.solani)以外，禾谷絲核菌(R.cerealis)，玉米絲核菌(R.zeae)和水稻絲核菌(R.oryzae)也可引起此病[1,10]。而此次研究分離獲得病原菌經(jīng)鑒定均為R.solani，說明我國華南地區(qū)褐斑病病原主要群體為R.solani。我國已有科技人員對華南地區(qū)草坪草病害進(jìn)行調(diào)查，翁啟勇等[9]報道了Rhizoctonia屬真菌可危害細(xì)葉結(jié)縷草，劉曉妹等[8]認(rèn)為R.solani可危害高爾夫球場果嶺狗牙根(Cynodondactylon)。然而，由R.solani導(dǎo)致細(xì)葉結(jié)縷草單個草種的褐斑病在我國鮮見報道。而且，筆者同時結(jié)合了病原菌形態(tài)特征和分子生物學(xué)特征對病原菌進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確確診了細(xì)葉結(jié)縷草褐斑病病原菌為R.solani。

立枯絲核菌褐斑病是分布于世界范圍內(nèi)的重要草坪草病害，它可侵染包括早熟禾(Poaspp.)、高羊茅(Festucaspp.)、黑麥草(Loliumspp.)、狗牙根(Cynodonspp.)、結(jié)縷草(Zoysiaspp.)在內(nèi)的多種草坪草[15,18]。該病害主要危害葉片、葉鞘和莖稈等部分，可引起苗腐、葉枯和莖基腐等嚴(yán)重癥狀。草坪褐斑病危害暖季型草坪草可形成較大的褐色枯草圈，因此，又叫做大斑病(large patch)[10]。試驗觀察到的褐斑病危害細(xì)葉結(jié)縷草形成的枯草斑可達(dá)3 m的大斑。由于枯草斑中心邊緣病株恢復(fù)較快，導(dǎo)致草坪呈現(xiàn)環(huán)狀蛙眼狀，即中央綠色，邊緣枯黃的環(huán)帶，在清晨露水較多或高濕時，病株可見菌絲纏繞，整個草坪呈現(xiàn)一副衰敗的景象。此次研究所觀察到的癥狀與褐斑病典型的癥狀相似，這些癥狀都將有助于該病害的鑒定。

化學(xué)防治是防治草坪草真菌病害最有效的方法，在使用化學(xué)殺菌劑過程中應(yīng)根據(jù)病害不同種類及特點選用防效較好的藥劑，減少化學(xué)藥劑的使用，從而降低對環(huán)境的污染。應(yīng)用生長速率測定法測定了9種殺菌劑對R.solani的毒力試驗，結(jié)果表明，在供試的9種藥劑中5%烯唑醇、43%戊唑醇、20%三唑酮和12.5%腈菌唑4種14-α-脫甲基反應(yīng)抑制劑類殺菌劑抑菌效果最好，其EC50在0.055～0.195 mg/L，李增平等[19]和楊繼堂等[20]室內(nèi)測定了多種殺菌劑對R.solani的毒力，結(jié)果同樣表明DMIs殺菌劑抑菌效果較好。DMIs類殺菌劑是19世紀(jì)60、70年代開發(fā)的一類廣譜、高效的內(nèi)吸型殺菌劑，對R.solani的防治效果顯著。而R.solani對50%多菌靈和70%甲基托布津2種苯并咪唑類(Methyl Benzimidazole Carbamates，MBCs)類殺菌劑敏感性較低。表明田間菌株已對MBCs類殺菌劑產(chǎn)生了一定抗藥性。因此，在采用化學(xué)方法防治草坪草褐斑病時，應(yīng)避免長期大量使用同一種類型的殺菌劑，降低病原菌產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險。

草坪草褐斑病是流行性很強(qiáng)的病害，早期只要有少許植株染病，不及時防治，病害很可能就會迅速擴(kuò)展，造成大片植株死亡，形成枯草斑[10]。因此，對于該病害的防治，首先需做好預(yù)測預(yù)報工作，在病害發(fā)生的早期就應(yīng)該對其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，提早做出預(yù)防方案[21]。除此之外，在建植草坪之前應(yīng)盡量選用抗病品種或采用多品種混播草坪[22]。盡量采取生物防治方法[23]，合理施肥、科學(xué)灌溉、改善草坪及土壤通氣透水條件，及時清理枯草層較少病殘體和菌源也可起到一定的防治效果。同時適量配合殺菌劑可對褐斑病起到較好的防效[24-27]。

4 結(jié)論

通過對病害田間為害癥狀，病原菌培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征及致病性進(jìn)行測定并結(jié)合病原菌分子生物學(xué)特征(rDNA-ITS序列)分析，將引起細(xì)葉結(jié)縷草褐斑病病原菌鑒定為R.solani，同時室內(nèi)測定9種殺菌劑對病原菌毒力的結(jié)果表明，5%烯唑醇對R.solani毒力最強(qiáng)，其EC50值為0.055 mg/L；毒力最低的為70%甲基托布津，其EC50值為7.021 mg/L。在供測殺菌劑中DMIs類殺菌劑對R.solani抑菌效果最好。