茅蒼術(shù)規(guī)?；M培快繁體系的建立

宋 剛，徐 銀，史 俊，謝正林

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

茅蒼術(shù)[Atractylodeslancea(Thunb.) DC.]，又名南蒼術(shù)、茅術(shù)、京蒼術(shù)，是菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，地下根狀莖經(jīng)炮制作蒼術(shù)入藥。茅蒼術(shù)在中國分布廣泛，主產(chǎn)于江蘇、浙江、山東、江西、廣東、安徽、湖北、四川等地區(qū)[1-2]。江蘇茅山地區(qū)是茅蒼術(shù)道地藥材的中心產(chǎn)區(qū)，品質(zhì)優(yōu)良的茅蒼術(shù)根莖斷面有黃白色或灰白色和棕紅色油腺，習(xí)稱“朱砂點(diǎn)”[3]。在傳統(tǒng)用藥中，茅蒼術(shù)揮發(fā)油部分是主要藥用成分，主要包括β-桉葉醇、茅術(shù)醇、蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮等，藥理藥性研究表明茅蒼術(shù)具有胃腸促進(jìn)、抗缺氧、抗血糖、抗菌、抑制癌細(xì)胞增殖等作用[4]。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明，茅蒼術(shù)還具有一定的抗HIV病毒的活性[5]。除藥用外，茅蒼術(shù)還可用作各種飲料的添加劑和加工工藝品香包[6]。傳統(tǒng)生產(chǎn)可以利用茅蒼術(shù)種子和根莖進(jìn)行繁殖，但存在種子生命力較差、繁殖系數(shù)較低；根莖繁殖時根莖需求量大、品質(zhì)易退化等弊端。通過組培快繁技術(shù)能在短期內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)無菌苗，滿足生產(chǎn)種苗需求。還能與生物技術(shù)育種結(jié)合選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新品種，開辟新的藥用資源，并對緩解供需矛盾，保護(hù)野生茅蒼術(shù)資源具有重要的意義。對茅蒼術(shù)組培快繁技術(shù)的研究已有報(bào)道[6-8]，所用外植體包括根莖側(cè)芽、胚根、胚軸、子葉、葉柄、葉片，通過直接誘導(dǎo)叢生芽和先誘導(dǎo)愈傷再分化成叢生芽再生途徑實(shí)現(xiàn)再生。在配方研究方面，李文等[9]采用正交設(shè)計(jì)篩選了南蒼術(shù)最佳增殖和生根培養(yǎng)基配方及試管苗移栽基質(zhì)配方。王紅娟等[10]通過均勻設(shè)計(jì)對茅蒼術(shù)增殖和生根培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，并比較了不同移栽基質(zhì)的效果。

前人研究中試驗(yàn)組合數(shù)偏少，研究目的偏向于再生體系建立，適合規(guī)模化工廠化生產(chǎn)的技術(shù)體系并未明確。本研究采用全面試驗(yàn)組合，旨在篩選適合生產(chǎn)用的高效增殖和生根培養(yǎng)基、同時對茅蒼術(shù)組培苗多次繼代，闡明其叢芽增殖變化規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)茅蒼術(shù)種苗工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茅蒼術(shù)植株2011年11月采集自句容茅山，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院主任中藥師宋金斌鑒定為野生茅蒼術(shù)；將其移栽于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物園。收集茅蒼術(shù)種子，經(jīng)無菌播種[11]培養(yǎng)成無菌苗(圖1-A)；選取葉色濃綠、植株粗壯的無菌苗作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 增殖培養(yǎng) 接種前于超凈工作臺上剪去茅蒼術(shù)無菌苗葉片、根系，將胚軸形成的芽苗切割成單芽，接入不同芽增殖培養(yǎng)基，每瓶接1個單芽，每處理接6瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)6周后統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)。

1.2.2 生根培養(yǎng) 取株高達(dá)到5 cm以上，葉片挺拔、葉色濃綠的單株健壯的幼苗，接種至不同生根培養(yǎng)基，每瓶接1株，每處理接6瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)3周后調(diào)查統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)、根系長勢情況。

1.2.3 馴化與移栽 挑選葉片數(shù)多于8片、不定根數(shù)多于15、苗高超過6 cm的壯苗，擰松瓶蓋先在溫室放置2 d，隨后在溫室自然光下鍛煉1周，移栽前打開瓶蓋，倒入少量水保持植株不萎縮。取出試管苗注意不要傷到根，洗凈培養(yǎng)基后定植于72孔穴盤，2周后調(diào)查其移栽成活率。

1.2.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 按表1所示，設(shè)計(jì)了16種增殖培養(yǎng)基和8種生根培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均分裝在組培瓶中，于122 ℃條件下滅菌20 min。培養(yǎng)時培養(yǎng)室溫度控制在(25±2) ℃，日光燈光照強(qiáng)度2000～2500 lx，時間12 h/d[12-13]。

表1 培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 按下列公式計(jì)算各指標(biāo)：

增殖系數(shù)=增殖叢生芽數(shù)/接種瓶數(shù)

生根率=(生根苗數(shù)/接種瓶數(shù))×100%

平均生根數(shù)=總生根數(shù)/接種瓶數(shù)

移栽成活率=(移栽成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù))×100%

利用Excel 2007和SPSS 20.0對統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多重比較采用Duncan’s檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖的影響

單芽接入培養(yǎng)基中，約1周可見新芽出現(xiàn)，陸續(xù)長出新葉。隨后有更多叢生芽產(chǎn)生，最后形成叢苗(圖1-B)。如表2所示，除了6、8、12、13、14、15號這6種培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)增殖出叢生芽，其余9種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)分化形成數(shù)量不等的叢生芽，其中3號培養(yǎng)基叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到15，為所有培養(yǎng)基中最高，并與其他處理間差異顯著(P<0.05)。

添加4.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基，雖然分別與4種不同濃度NAA搭配組合，但各組合都未有叢芽分化形成，說明在培養(yǎng)基中過高濃度的6-BA會抑制茅蒼術(shù)單芽分化形成叢芽，相對較低濃度的6-BA與NAA組合能夠誘導(dǎo)出叢生芽。而在形成叢芽的培養(yǎng)基當(dāng)中，添加了1.0 mg/L的和部分2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基有少量同時誘導(dǎo)產(chǎn)生了愈傷組織，這些愈傷組織呈綠色到棕色，位于叢芽基部胚軸位置，隨著叢芽增多而增大。愈傷組織的產(chǎn)生并未明顯影響到叢生芽的分化。

對各培養(yǎng)基中叢苗長勢進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，1～4號培養(yǎng)基中叢苗比較健壯，而其他培養(yǎng)基中叢苗長勢偏弱，葉色偏淺，部分甚至發(fā)黃。

2.2 不同繼代次數(shù)對叢苗增殖的影響

將3號培養(yǎng)基增殖的叢苗分成單芽(圖1-C)繼代培養(yǎng)于相同培養(yǎng)基，每隔4周繼代一次，連續(xù)繼代8次。每代調(diào)查每瓶平均葉片數(shù)、平均苗高和增殖系數(shù)，并描述芽苗生長狀況。結(jié)果如表3所示，8代繼代苗每瓶苗平均葉片數(shù)在34～43之間。平均苗高在5.95～6.33 cm之間，各代間差異不顯著。增殖系數(shù)前3代與后5代差異顯著(P<0.05)；從第4代開始增殖系數(shù)趨于穩(wěn)定，到第6代達(dá)最高值12.33。在增殖苗長勢方面，1～5代苗的生長狀況正常，葉形挺拔、葉色濃綠、株型勻稱規(guī)則；從第6代起出現(xiàn)少部分苗長勢偏弱，有葉萎縮卷曲、葉色偏淡轉(zhuǎn)黃現(xiàn)象，但沒有白化、玻璃化、黃化苗出現(xiàn)。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對茅蒼術(shù)叢芽增殖的影響

注：不同小寫字母表示差異達(dá)到P<0.05的顯著水平。下同。

表3 不同繼代次數(shù)對茅蒼術(shù)叢苗增殖的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對生根的影響

取生長8周的一致單株壯苗(圖1-D)，接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后調(diào)查生根狀況，結(jié)果如表4、圖1-E所示。根系長勢采用“+++”(表示根長度長于8 cm、數(shù)量達(dá)到15根以上)、“++”(根系長度長于5 cm，數(shù)量10根以上)和“+”(根系長度短于5 cm，數(shù)量較少)三等級表示。在8種生根培養(yǎng)基中，3、4、5、6號培養(yǎng)基的生根率、平均生根數(shù)、根系長勢都與其余4種差異明顯，顯然不適合作為茅蒼術(shù)工廠化生產(chǎn)的生根培養(yǎng)基。1號對照與2、7、8號培養(yǎng)基比較，生根率都為100%，但平均生根數(shù)顯著減少，根系長勢也偏弱。

2、7、8號培養(yǎng)基分別添加活性炭、NAA及活性炭+NAA，它們的平均生根數(shù)分別為24.9、25.7和24.8，彼此差異不顯著，根系長勢也一致，都到達(dá)+++級別。

表4 不同類型培養(yǎng)基對茅蒼術(shù)生根的影響

2.4 組培苗的移栽

茅蒼術(shù)組培苗移栽基質(zhì)采用泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1，高壓蒸汽滅菌處理。移栽后穴盤置于溫室，相對濕度保持80%以上，每周噴施0.1%多菌靈一次，常規(guī)管理移栽苗。兩周后以產(chǎn)生新葉植株為移栽成活判斷標(biāo)準(zhǔn)(圖1-F)。經(jīng)調(diào)查成活率達(dá)95%，后續(xù)可移入盆栽(圖1-C)，一年后可地栽(圖1-H)。

A.無菌苗;B.叢生芽;C.單芽;D.試管苗；E.生根苗；F.移栽苗；G.盆栽苗；H.地栽苗圖1 茅蒼術(shù)高效快繁技術(shù)體系

3 討論與結(jié)論

巢建國等[7]研究發(fā)現(xiàn)茅蒼術(shù)胚軸分化能力最強(qiáng)，每段能產(chǎn)生8～10個新芽。王紅娟等[10]研究茅蒼術(shù)胚軸叢芽增殖最佳培養(yǎng)基，平均增殖系數(shù)為(10.0±0.71)。植物生長調(diào)節(jié)劑是植物組織培養(yǎng)器官分化的關(guān)鍵因素，形成器官的類型由培養(yǎng)基中不同植物生長調(diào)節(jié)劑的相對質(zhì)量濃度控制，而不是由這些物質(zhì)的絕對質(zhì)量濃度決定[14]。本研究使用6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.15 mg/L的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，芽增殖系數(shù)達(dá)到最高15.0，高于前人的研究結(jié)果，這說明這2種植物生長調(diào)節(jié)劑的相對濃度比例較合適，對芽的增殖起到較好的促進(jìn)作用。

利用此增殖培養(yǎng)基對茅蒼術(shù)叢芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)，共繼代到8代。試驗(yàn)結(jié)果顯示，4代以后增殖系數(shù)顯著增加，一直到第8代，并且繼代苗高度和葉片數(shù)各代間差異不大，叢苗生長狀況良好。通常在種苗快繁與保存時，無菌繁殖體系在培養(yǎng)基中激素的作用下，分生組織不斷分化，能連續(xù)多代增殖。曹孜義等[15]對葡萄離體培養(yǎng)48～80代后發(fā)現(xiàn)增殖倍數(shù)并未降低。蘋果新梢外植體繼代培養(yǎng)100余次，其器官再生能力沒有顯著變化[16]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，表明在茅蒼術(shù)工廠化快繁生產(chǎn)中能使用此培養(yǎng)基多次繼代，在組培苗生根前獲得充足的中間繁殖體。

培養(yǎng)基中添加活性炭能為根的生長發(fā)育營造近似自然生長條件下的黑暗環(huán)境，吸附培養(yǎng)基中有毒副作用的物質(zhì)，降低鹽離子濃度，因而活性炭可以促進(jìn)不定芽生根和生長。張素勤等[17]研究發(fā)現(xiàn)1/2MS中添加0.2%～0.3%活性炭能明顯促進(jìn)非洲菊不定芽生根，縮短生根時間，增加根數(shù)和根長。在本試驗(yàn)中，1/2MS添加0.5%活性炭與未添加活性炭平均生根數(shù)比較差異顯著，說明添加活性炭有利于茅蒼術(shù)生根。此外，1/2MS添加0.15 mg/L NAA的生根效果與添加活性炭類似，但兩者均添加的培養(yǎng)基中并沒有表現(xiàn)出明顯增加、乃至倍增的生根效果，原因有待進(jìn)一步深入研究。我們認(rèn)為，與在生根培養(yǎng)基中添加生長素相比，添加活性炭取材容易、操作簡便、無激素積累，更適合在工廠化生產(chǎn)中推廣使用。

本研究以茅蒼術(shù)無菌苗為材料，分別從16種增殖培養(yǎng)基和8種生根培養(yǎng)基中篩選出適合工廠化大規(guī)模生產(chǎn)用培養(yǎng)基。叢芽增殖培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，可進(jìn)行多次繼代增殖。生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.5%活性炭。采用泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1的基質(zhì)移栽成活率達(dá)95%。利用該體系可進(jìn)行茅蒼術(shù)組培苗高效擴(kuò)繁，為規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。