小鼠胰島結(jié)合生物膠經(jīng)皮下移植治療小鼠糖尿病的研究

王佳微 傅紅興 趙應(yīng)征 楊麗斌 耿武軍

【摘要】目的 將含bFGF的生物膠與小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)結(jié)合，與不含bFGF生物膠的胰島細(xì)胞團(tuán)對比研究bFGF對糖尿病小鼠胰島皮下移植后的療效，并進(jìn)行功能性評價。方法 將分離、純化、培養(yǎng)后的胰島細(xì)胞與含有bFGF的生物膠結(jié)合移植到小鼠的皮下，將移植后皮下組織進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。同時與不含bFGF生物膠的皮下胰島移植相比較。結(jié)果 含bFGF生物膠的胰島細(xì)胞團(tuán)經(jīng)皮下移植與不含bFGF生物膠的小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)相比，小鼠血糖有所下降，但持續(xù)時間并不久，療效不是十分顯著。結(jié)論 含bFGF透明質(zhì)酸鈉膠與胰島共移植，可以在一定程度上促進(jìn)胰島移植后微血管重建。

【關(guān)鍵詞】糖尿病小鼠；胰島移植；堿性成纖維生長因子；透明質(zhì)酸鈉膠

【中圖分類號】R587 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.18..02

bFGF是堿性成纖維細(xì)胞生長因子，是體內(nèi)已知的作用最強(qiáng)的促血管生長因子[1]。本實驗通過有無結(jié)合含bFGF的生物膠與胰島細(xì)胞團(tuán)共移植的比較，監(jiān)測血糖和體重變化，并且通過HE染色和免疫組化染色進(jìn)行組織學(xué)評價，探測bFGF在體內(nèi)對小鼠胰島微血管修復(fù)的影響及通過血管修復(fù)對于控制血糖的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Balb/c小鼠10只，體重約22 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑和實驗器材

Ⅴ型膠原酶（Sigma公司，美國）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、CMRL 1066培養(yǎng)液（溫州怡康細(xì)胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司，中國）；Hanks液（自配）；胎牛血清（四季青公司）；二乙酸熒光素（FD）（Sigma公司）；Anti-Insulin（Abcam公司）；bFGF（浙江格魯斯特生物科技有限公司）；透明質(zhì)酸鈉（湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 60 ng/mL bFGF透明質(zhì)酸鈉膠制備

（1）精密稱取20 mg透明質(zhì)酸鈉粉末至1支4 mL無菌的EP管中，蓋子不用蓋緊，將其用紗布包裹后放入滅菌盒中；（2）將其置于高溫高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌時間為5～10 min；（3）將滅菌好的裝有透明質(zhì)酸鈉粉末的EP管置于超凈工作臺中，向此EP管中加入2 mL 60 ng/mL bFGF細(xì)胞培養(yǎng)液，攪拌均勻使其成半流動性凝膠狀，即得到10 mg/mL含60 ng/mL bFGF透明質(zhì)酸鈉膠；（4）用封口膜封口后置于4℃冰箱過夜保存，以去除配制中產(chǎn)生的氣泡。

1.2.2 ICR小鼠皮下移植

（1）將準(zhǔn)備移植的糖尿病小鼠在移植前20 min皮下注射50 μL頭孢唑啉鈉，小鼠采用持續(xù)吸入異氟烷麻醉；（2）待小鼠麻醉后，剃去腹股溝處周圍毛發(fā)，暴露的皮膚用酒精擦拭消毒，用眼科剪剪開外皮，用鑷子輕柔提起里面的肌肉層，剪開肌肉層后，用1 mL注射器針頭在皮下輕輕刺破一個小孔，在體視顯微鏡下，將準(zhǔn)備好的胰島通過小孔緩緩注射入皮下，注射充分后緩緩拔出注射器并用鑷子輕輕夾住注射部位的小孔，以防胰島細(xì)胞溢出；（3）待出血停止后輕輕提拉肌肉層，縫合傷口，縫合時先第一針?biāo)膫€外科手術(shù)結(jié)固定，然后連續(xù)縫針，最后一針再與上一針進(jìn)行四個外科手術(shù)結(jié)固定，剪掉多余線；（5）小鼠放回籠子，1 min左右小鼠即蘇醒，整個手術(shù)過程約20 min。

1.2.3 術(shù)后消炎及血糖監(jiān)測

術(shù)后每8 h皮下注射50 μL或每12 h注射100 μL頭孢唑啉鈉抗炎，持續(xù)一周，防止炎癥因子對胰島移植物的影響。手術(shù)后6、12、24、48 h測定血糖，之后每周測定一次血糖，直至血糖超過11.1 mmoL/L后宣告移植物失效，記錄術(shù)后血糖和體重的變化。

2 結(jié) 果

2.1 移植后血糖監(jiān)測結(jié)果

通過血糖變化曲線（圖1）可知，加生物膠的移植組比不加生物膠的移植組起效時間持久。由體重變化曲線（圖2）可知，加生物膠的移植組比不加生物膠的移植組體重增加的速率稍快。

2.2 HE染色和免疫組化染色結(jié)果

各實驗組在移植后10天將移植部位的皮膚組織取下，通過HE染色和免疫組化來評價含bFGF生物膠移植的實驗組中皮下胰島的形態(tài)和Insulin的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。

在結(jié)果（圖3-A）HE染色中可知，胰島數(shù)目不是很多，而且形態(tài)不是很完整。在免疫組化結(jié)果B中可看出，皮下組織存在的Insulin陽性細(xì)胞較少。

3 討 論

本實驗通過有無結(jié)合含bFGF的生物膠與胰島共移植比較，監(jiān)測血糖和體重變化，并且通過HE染色和免疫組化染色進(jìn)行組織學(xué)評價，探測了bFGF在體內(nèi)對小鼠胰島皮下移植療效的影響。通過實驗可知，盡管皮下移植的療效并不理想，胰島可能因各種原因引起凋亡而失活[2]，但可避免在初期因血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)（IBMIR）加含bFGF的生物膠的移植組血糖控制效果優(yōu)于不加含bFGF的生物膠的移植組。也說明，bFGF能夠改善胰島移植的相關(guān)功能指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] Li W，Zhao R，Liu J，et al.Small Islets Transplantation Superiority to Large ones：Implications from Islet Microcirculation and Revascularization.J Diabetes Res 2014，2014：192093.

[2] Yin N，Han Y，Xu H，et al.VEGF-conjugated Alginate Hydrogel Prompt Angiogenesis and Improve Pancreatic Islet Engraftment and Function in Type 1 Diabetes.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.2016，59：958-964.

本文編輯：趙小龍