甲硝唑氯化鈉注射液無菌檢查方法適用性試驗(yàn)

夏天 崔迎 李宏鐸

[摘要] 目的 按照《中國藥典》2015版四部無菌檢查法（通則1101）對(duì)甲硝唑氯化鈉注射液進(jìn)行無菌檢查方法適用性試驗(yàn)，建立優(yōu)化的甲硝唑氯化鈉注射液無菌檢查方法。 方法 試驗(yàn)采用薄膜過濾法，以0.1%無菌蛋白胨水溶液為沖洗液，每膜沖洗量從100 mL開始遞增，最大沖洗量為每膜1000 mL，分別進(jìn)行3次試驗(yàn)，第1次使用沖洗液直接沖洗樣品，第2次使用含0.13%聚山梨酯80的沖洗液，第3次使用含0.2%聚山梨酯80的沖洗液。 結(jié)果 試驗(yàn)一：生孢梭菌試驗(yàn)組均不生長(zhǎng)；試驗(yàn)二：當(dāng)沖洗量達(dá)到最大值（每膜1000 mL）時(shí)，試驗(yàn)組生長(zhǎng)良好；試驗(yàn)三：當(dāng)沖洗量達(dá)到每膜500 mL時(shí)，可消除甲硝唑的抑菌性，試驗(yàn)組生長(zhǎng)良好。 結(jié)論 甲硝唑氯化鈉注射液（100 mL：甲硝唑0.5 g與氯化鈉0.8 g）可采用薄膜過濾法（每濾筒10瓶供試品，以含0.2%聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液為沖洗液，沖洗5次，每膜100 mL/次）進(jìn)行無菌檢查，以生孢梭菌作為陽性對(duì)照菌。

[關(guān)鍵詞] 甲硝唑氯化鈉注射液；無菌檢查；適用性試驗(yàn)；聚山梨酯80

[中圖分類號(hào)] R927.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（c）-0121-05

[Abstract] Objective To establish optimized sterility test method of Metronidazole and Sodium Chloride Injection according to the suitability test of sterility test for Metronidazole and Sodium Chloride Injection by the sterility test method （general rule 1101） in Chinese Pharmacopoeia （2015）. Methods The test applied membrane filtration method and used 0.1% sterile peptone solution as rinse solution. The rinsing amount of per membrane was increased from 100 mL to the maximum amount of 1000 mL per membrane. Three separate tests were performed. The sample was directly rinsed with the rinse solution for the first time， the rinse solution containing 0.13% and 0.2% polysorbate 80 were used for the second and third time respectively. Results In test one， the Clostridium sporogenes test group did not grow； in test two， the test group grew well when the rinsing amount reached the maximum （1000 mL per membrane）； in test three， the antibacterial effect of Metronidazole could be eliminated and the test group grew well when the rinsing amount reached 500 mL per membrane. Conclusion Metronidazole Sodium Chloride Injection （100 mL： Metronidazole 0.5 g and Sodium Chloride 0.8 g） should be sterilized by membrane filtration （10 bottles for each filter cartridge， 0.1% sterile peptone solution containing 0.2% polysorbate 80 as the rinse solution， rinsed for 5 times， 100 mL/time per film）， using Clostridium sporogenes as a positive control.

[Key words] Metronidazole and Sodium Chloride Injection； Sterility test； Suitability test； Polysorbate 80

甲硝唑氯化鈉注射液主要用于治療或預(yù)防部分厭氧菌引起的系統(tǒng)或局部感染[1]。甲硝唑是一種硝基咪唑的衍生物，能抑制阿米巴原蟲氧化還原反應(yīng)[2]，且殺滅滴蟲作用極強(qiáng)，同時(shí)對(duì)大多數(shù)厭氧菌有抗菌作用，而對(duì)需氧菌和兼性厭氧菌無作用[3]。因此，必須有效地消除其對(duì)厭氧菌的抑制作用，才能建立甲硝唑氯化鈉注射液的無菌檢查方法，從而檢出樣品中可能存在的其他微生物。聚山梨酯80是一種親水型非離子表面活性劑[4]，在藥品微生物限度檢查中常被用作中和劑，而在無菌檢查中被用在稀釋液或沖洗液中作為增溶劑[5]。通過調(diào)節(jié)其在溶液中的濃度，可以增加藥物的溶解度[6]，減少無菌培養(yǎng)器內(nèi)的藥物殘留，消除樣品對(duì)陽性菌的抑菌作用，建立適宜的無菌檢查方法[7]。本試驗(yàn)依照《中國藥典》2015版四部無菌檢查法（通則1101）中的規(guī)定進(jìn)行無菌檢查方法適用性試驗(yàn)[8]，建立甲硝唑氯化鈉注射液無菌檢查方法。

1 儀器與材料

本試驗(yàn)的供試品為甲硝唑氯化鈉注射液（西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1701222A，1702041G，1703102A，規(guī)格100 mL：甲硝唑0.5 g與氯化鈉0.8 g）。本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境符合《中國藥典》2015版四部藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則（通則9203）和藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則（通則9205）中的相關(guān)規(guī)定[8]。主要儀器有生物安全柜[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號(hào)：THERMO1378]，滅菌器[TOMY（日本）公司，型號(hào)：SX-500]，集菌儀（Merk Milipore，型號(hào)：SYMBLFH03）。試驗(yàn)所用菌種分別為枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，以上菌種均由中國食品藥品檢定研究院提供[9]。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基、稀釋液和沖洗液全部按照《中國藥典》2015年版四部無菌檢查法（通則1101）中的要求配制[8]，均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。試驗(yàn)用試劑為聚山梨酯80（批號(hào)：20140422）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

按照《中國藥典》2015年版四部無菌檢查法（通則1101）[8]，方法適用性試驗(yàn)中菌種及菌液制備的要求，將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、黑曲霉、白色念珠菌分別制成菌數(shù)（孢子數(shù)）小于100 cfu/mL的菌（孢子）懸液。各菌液濃度計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

2.2 方法適用性試驗(yàn)一

取同批次供試品，每濾筒10瓶供試品，以無菌操作消毒處理、備用[10]。采用薄膜過濾法，以0.1%無菌蛋白胨水溶液為沖洗液，分別沖洗1、2、3、5、10次，每次100 mL/膜，同時(shí)在最后1次沖洗液中，分別加入上述“2.1”中制備的小于100 cfu的各試驗(yàn)菌菌液，過濾完之后，再加入相應(yīng)的100 mL培養(yǎng)基置濾筒內(nèi)，按規(guī)定溫度培養(yǎng)，逐日觀察，培養(yǎng)時(shí)間不得超過5 d，作為試驗(yàn)組。另外將裝有等量培養(yǎng)基的濾筒，加入上述各試驗(yàn)菌，作為對(duì)照組。再取同批次供試品60瓶，同法操作，不加試驗(yàn)菌，作為供試品對(duì)照組；最后取沖洗液，同法操作，不加試驗(yàn)菌，作為陰性對(duì)照。從表2中可以看出，3批供試品的試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，除生孢梭菌試驗(yàn)組未生長(zhǎng)外，其他菌種在規(guī)定時(shí)間內(nèi)均可正常生長(zhǎng)，說明供試品中仍有甲硝唑成分殘留，抑制了生孢梭菌生長(zhǎng)。應(yīng)采用增加沖洗量或使用中和劑等方法重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。本試驗(yàn)將采用含一定濃度聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液為沖洗液，在不影響微生物生長(zhǎng)的前提下，消除樣品中的抑菌成分。

2.3 聚山梨酯80濃度的確定

聚山梨酯80是表面活性劑的一種，表面活性劑的分子具有兩親結(jié)構(gòu)，當(dāng)表面活性劑達(dá)到一定濃度時(shí)，親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)在溶液中將會(huì)出現(xiàn)平衡狀態(tài)[11]，此時(shí)溶液表面張力開始下降，若繼續(xù)增加表面活性劑的濃度，樣品溶液中的表面活性劑分子就會(huì)形成聚集體，稱之為“膠束”，從而增加藥物的溶解度[12]。把開始形成膠束時(shí)的表面活性劑的濃度稱之為臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）[13]。因此要確定聚山梨酯80的使用量，首先要知道其CMC值。通過查閱文獻(xiàn)資料，得知聚山梨酯80的CMC值為1.4×10-2 g/L（25℃下）[14]，再經(jīng)過換算得到本次實(shí)驗(yàn)所用的聚山梨酯80的濃度為0.13%（mL/100 mL），故將其確定為沖洗液中聚山梨酯80的使用濃度。

2.4 方法適用性試驗(yàn)二

采用薄膜過濾法，取同批次供試品，按每濾筒10瓶供試品，以含0.13%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液，分別沖洗2、4、6、8、10次，每膜100 mL/次。再加入相應(yīng)的100 mL培養(yǎng)基置濾筒內(nèi)，按規(guī)定溫度培養(yǎng)，逐日觀察，培養(yǎng)3～5 d。試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組與陰性對(duì)照組試驗(yàn)操作同方法適用性試驗(yàn)一，僅沖洗量按照上述操作。從表3中看出，以含0.13%聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液作為沖洗液，當(dāng)沖洗量達(dá)到《中國藥典》規(guī)定的最大值（沖洗量不得超過1000 mL/膜）[8]，才能夠消除供試品中甲硝唑的抑菌性，說明聚山梨酯80的濃度在CMC值時(shí)雖然可以增溶甲硝唑，但大量的沖洗難免造成微生物菌體的損傷，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且還會(huì)影響濾膜的孔徑[15]，加之耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁復(fù)，該方法并不適宜作為最終甲硝唑氯化鈉注射液的無菌檢查方法[16]。若繼續(xù)增加聚山梨酯80的用量，可在消除樣品中殘留甲硝唑成分的同時(shí)減少?zèng)_洗量，建立優(yōu)化的無菌檢查方法。

2.5 方法適用性試驗(yàn)三

使用薄膜過濾法，取同批次供試品，按每濾筒10瓶供試品，以含0.2%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液，分別沖洗1、2、3、4、5次，100 mL/次。再加入相應(yīng)的100 mL培養(yǎng)基置濾筒內(nèi)，按規(guī)定溫度培養(yǎng)，逐日觀察，培養(yǎng)3～5 d。試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組與陰性對(duì)照組試驗(yàn)操作同方法適用性試驗(yàn)一，僅沖洗量按照上述操作。結(jié)果見表4。方法適用性試驗(yàn)三的結(jié)果表明，當(dāng)沖洗量達(dá)到500 mL/膜時(shí)，與對(duì)照組比較，含供試品各試驗(yàn)組的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，因此該方法可作為甲硝唑氯化鈉注射液的無菌檢查方法。

3 討論

聚山梨酯80是一種增溶劑，屬于親水性非離子表面活性劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)有較長(zhǎng)的碳鏈，對(duì)含親脂性基團(tuán)的藥物有良好的助溶作用，且常用作穩(wěn)定劑保護(hù)藥品的穩(wěn)定性。甲硝唑含有R1位親脂基團(tuán)，微溶于水，聚山梨酯80與甲硝唑結(jié)合后，增加了甲硝唑在溶液中的溶解度，再調(diào)整沖洗量將殘留的甲硝唑徹底沖洗干凈，以達(dá)到消除其抑制厭氧菌的作用。溶液達(dá)到臨界膠束濃度時(shí)，若繼續(xù)提高聚山梨酯80濃度，會(huì)有大量膠團(tuán)形成，而多余的聚山梨酯80在甲硝唑分子結(jié)構(gòu)外會(huì)包裹一層水化膜，不僅能有效地阻止甲硝唑分子之間互相接觸，使溶液能迅速通過濾膜[17]，同時(shí)也會(huì)降低細(xì)菌菌體與培養(yǎng)基接觸面之間的表面張力，使外圍營養(yǎng)物質(zhì)更快地進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)菌快速生長(zhǎng)[18]。因此，聚山梨酯80的濃度應(yīng)達(dá)到或者稍大于CMC值。

本試驗(yàn)分別采用三種沖洗液：0.1%無菌蛋白胨水溶液、含0.13%聚山梨酯80與含0.2%聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液，在不影響微生物生長(zhǎng)的前提下可消除樣品中的抑菌成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，以0.1%無菌蛋白胨水溶液為沖洗液，即使沖洗量達(dá)到藥典規(guī)定的最大限制每膜1000 mL，仍不能消除樣品中甲硝唑的抑菌性，這與其他文獻(xiàn)中的結(jié)果稍有出入[19]，并不代表試驗(yàn)結(jié)果不可信，可能是試驗(yàn)條件不同與供試品不同所導(dǎo)致的；含0.13%聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液，在沖洗量達(dá)到1000 mL/膜時(shí)，才能中和供試品中的抑菌成分；用含0.2%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液，當(dāng)沖洗量達(dá)到500 mL/膜時(shí)，生孢梭菌即生長(zhǎng)良好，符合《中國藥典》2015年版四部通則1101無菌檢查法的要求[8]。試驗(yàn)二與試驗(yàn)三的結(jié)果正好驗(yàn)證了上述結(jié)論，即聚山梨酯80的濃度應(yīng)達(dá)到或稍大于CMC值。值得關(guān)注的一點(diǎn)是，在甲硝唑氯化鈉注射液無菌檢查試驗(yàn)中，硫乙醇酸鹽流體作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)生孢梭菌時(shí)要注意培養(yǎng)時(shí)間的控制，培養(yǎng)至18 h時(shí)，生孢梭菌生長(zhǎng)旺盛，呈單個(gè)典型的傘狀菌落，未出現(xiàn)融合與擴(kuò)散現(xiàn)象，便于觀察和計(jì)數(shù)。培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)增加，菌落會(huì)呈現(xiàn)大片融合狀態(tài)[20]，不利于觀察。

本次方法適用性試驗(yàn)提示，甲硝唑是一種能夠有效抑制厭氧菌的藥物，考慮到?jīng)_洗量較大會(huì)損傷微生物，以及檢出陽性的可能性降低，最終確定甲硝唑氯化鈉注射液（100 mL：甲硝唑0.5 g與氯化鈉0.8 g）可采用薄膜過濾法（每濾筒取10瓶供試品，以含0.2%聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液為沖洗液，沖洗5次，100 mL/次）進(jìn)行無菌檢查，以生孢梭菌作為陽性對(duì)照菌。

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