納米磁珠技術相關毒理實驗研究

王欣 張黎明

[摘要] 目的 研究納米磁珠相關毒理，了解其在大鼠體內(nèi)分布代謝情況。 方法 選取24只健康成年大鼠隨機分為8組，每組3只，一組未做任何處理作為空白對照組，一組注射生理鹽水作為陽性對照組，其余6組注射納米氧化鐵磁珠作為實驗組。觀察各組大鼠生長發(fā)育情況、行為學及神經(jīng)功能改變情況。采用HE染色及普魯士藍染色觀察實驗組大鼠臟器結構是否改變，是否造成局部炎性反應等病理性改變及磁珠在動物主要臟器中的分布情況。另選取10只大鼠隨機分為兩組，每組5只，分別注射氧化鐵磁珠和生理鹽水，通過水迷宮實驗觀察大鼠認知功能。另取4只健康新西蘭家兔，觀察注射氧化鐵磁珠后血清學相關指標的變化情況。 結果 實驗組大鼠與空白對照組均未見生長、外觀異常表現(xiàn)；Longa評分均為0分，未見異常變化。水迷宮實驗逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)評分組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。各實驗組大鼠臟器形態(tài)未見結構及病理改變，氧化鐵磁珠在注入大鼠體內(nèi)5 min后已經(jīng)離開循環(huán)系統(tǒng)進入各種臟器，磁珠大部分分布在脾臟及肝臟。與未注射氧化鐵磁珠的家兔相比，注射65 d后家兔肌酐值增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但肌酐值仍在家兔血液化驗指標正常范圍內(nèi)。其他血清生化指標、鐵系列指標及血常規(guī)指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 納米磁珠技術在大鼠和家兔體內(nèi)未見明顯毒理反應，但納米磁珠技術相關毒理仍有待進一步探究。

[關鍵詞] 納米磁珠；毒理研究；體內(nèi)分布

[中圖分類號] R916.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（c）-0009-05

[Abstract] Objective To study the toxicology of nanomagnetic beads and to understand the distribution of metabolism in rats. Methods Twenty-four healthy adult rats were randomly divided into 8 groups with 3 rats in each group. One group without any treatment as a blank control group， one group was injected with normal saline as positive control group， the other 6 groups were injected with nano-oxidized iron magnetic beads as the experimental group， the growth， behavior and neurological changes of the rats of each group were observed. HE staining and Prussian blue iron staining were used to observe the changes of organ structure and local pathological changes such as inflammatory reaction of rats in the experimental groups， and the distribution of magnetic beads in the main organs of the rats. Ten rats were randomly divided into two groups， and with 5 rats in each group， rats in the two groups were injected with ferromagnetic beads or normal saline respectively， and the cognitive function of rats was observed. Blood of 4 healthy New Zealand rabbits were collected after the injection of iron oxide magnetic beads and changes of related indexes were observed. Results There was no abnormal growth or appearance in the experimental group and the blank control group. The Longa score was 0， no abnormal changes were observed. Water maze experiments of the two groups including the escape latency and the number of crossing platforms were scored， there was no statistically significant （P > 0.05）. There were no structural and pathological changes in the organ morphology of the rats in each group. The iron oxide magnetic beads had left the circulatory system and entered various organs of the rats after being injected for 5 minutes. Most of the magnetic beads were distributed in the spleen and liver. The difference in creatinine levels at different time points after injecting iron oxide magnetic beads in rabbits was statistically significant （P < 0.05）， but still in the normal range. Other serum biochemical indicators， iron series indicators and blood routine indicators were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion There is no obvious toxicological reaction by nanomagnetic beads. The toxicology related to nanomagnetic beads remain to be further explored.

[Key words] Nonomagnetic beads； Toxicological studies； Tissue distribution

急性腦梗死是常見的腦血管病變之一，具有高致死、致殘風險，且近年來有研究表明，急性腦梗死發(fā)病率不僅逐年上升，并有年輕化趨勢[1-2]。當前急性腦梗死的臨床治療仍以藥物治療為主，但受梗死時間窗、出血風險、藥物費用等因素制約，仍未能取得極滿意療效。納米磁珠技術是納米微粒與磁控技術的結合，可通過磁場控制納米微粒運動，而運動和旋轉的納米微粒產(chǎn)生的機械力不僅可洗刷血栓，達到清除或減小血栓以恢復梗死區(qū)域血供的目的，并具藥物載體功能?；诶碚摶A，其用于急性腦梗死具一定可行性[3-4]。但納米磁珠技術相關毒理研究尚有缺失[5]，本研究以此為方向，旨在進一步補充及完善納米磁珠技術的臨床應用，具體報道如下：

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取34只健康成年SD大鼠（北京華阜生物科技，許可證號：SCXK京2014-0004），雌雄參半，體重240～250 g，5～7周齡。大鼠均健康狀態(tài)良好，食欲旺盛，眼睛有神，反應敏捷，無彎尾，體無傷痕，天然空腔未見分泌物，無畸形，糞便黑色，呈麥粒狀。大鼠生存環(huán)境：溫度21.3～22.7℃，濕度51.87%～55.0%。

另選取4只健康新西蘭白色家兔（上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司，許可證號SCXK滬2007-0007），雌雄參半，體重（2.09±0.15）kg，生存環(huán)境：16～26℃，濕度40%～70%。

所有實驗動物均自由攝取食物，所有食物均經(jīng)高壓蒸汽滅菌，墊料及過濾水更換頻率為2 d/次。

1.2 實驗方法

1.2.1 取24只大鼠隨機分為8組，每組3只大鼠，隨機取一組不做處置作為空白對照組；一組大鼠注射生理鹽水，總劑量為大鼠血容量的5%，作為陽性對照組；其余6組大鼠作為實驗組經(jīng)尾靜脈注射濃度為5 mg/mL氧化鐵磁珠，總劑量為大鼠血容量的5%。隨后觀察各組大鼠外觀，記錄空白對照組、陽性對照組以及實驗組注射后5 min、30 min、7 d、35 d、65 d、100 d時分別行Longa功能評分[6]，該評分法將大鼠神經(jīng)學檢查按0～4分分為5個等級，依次對應正常、無神經(jīng)功能缺損；左側前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；行走時，大鼠向左側（癱瘓側）轉圈，中度神經(jīng)功能缺損；行走時，大鼠向左側（癱瘓側）轉圈，中度神經(jīng)功能缺損；不能自發(fā)行走、有意識喪失。分值與神經(jīng)功能缺損程度呈正相關?？瞻讓φ战M及注射后5 min、注射后30 min、注射后7 d、注射后35 d、注射后65 d、注射后100 d的實驗組大鼠分別處死，取主要臟器，包括腦、心、肺、肝、脾、腎臟等，先觀察主要臟器大體形狀、表面色澤、質地等。在每個臟器取大小為1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織，采用4%中性甲醛溶液固定并制備常規(guī)石蠟切片，對臟器組織做HE染色，通過光學顯微鏡進行病理學觀察，觀察實驗動物臟器結構是否改變、是否造成局部炎性反應等病理性改變。取大小為1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織，采用普魯士藍染色法顯微鏡下觀察磁珠在大鼠腦、心、肺、肝、脾、腎臟等主要臟器中的分布情況。染色采用伊紅法，亞鐵氰化鉀和鹽酸按比例配置Perls染液，現(xiàn)用現(xiàn)配，依次脫蠟、染色、伊紅復染、脫水、中性樹膠封片。

1.2.2 取10只大鼠，雌雄參半，隨機分為兩組，分別經(jīng)尾靜脈注射濃度為5 mg/mL氧化鐵磁珠和生理鹽水，劑量同為大鼠血容量的5%。注藥120 d后，10只大鼠進行水迷宮實驗[7]。 Morris水迷宮平臺藏于水面下1～2 cm處，水溫（22±2）℃，水中加墨汁，水池壁分別等分為4個象限并進行標記，選取第三象限正中位置放入平臺迷宮外參照物保持固定，分別對大鼠進行5 d的定位航行試驗和1 d空間探索試驗，記錄逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)。

1.2.3 取4只家兔，均經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為5 mg/mL的氧化鐵磁珠，注射劑量為家兔血容量的5%，分別于注射前、注射后7 d、注射后65 d時采集家兔耳靜脈血，3000 r/min離心10～15 min（離心半徑13.5 cm，離心溫度4℃），取血清，使用日本東亞SP-3000血細胞分析儀進行血常規(guī)檢測，日本Olympus公司5400全自動生化分析儀檢測生化指標，檢測指標包括：①生化指標，包括谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、鉀（K）、鈉（Na）、總膽固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）；②鐵系列指標，包括血清鐵、鐵蛋白、總鐵結合力；③血常規(guī)化驗指標，包括白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（Hb）、血細胞比容（Hct）、平均紅細胞血紅蛋白體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、血小板（PLT）計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素F方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠外觀及行為學改變情況

空白對照組與實驗組大鼠均未見異常生長，無大鼠死亡事件發(fā)生，皮毛、色澤正常，飲食、糞便顏色及性質、呼吸均未見明顯異常，體重均有增加，注射前及注射后不同時間點各組大鼠活動量、反應能力等均未出現(xiàn)明顯異常，Longa評分均為0分，未見異常變化，且兩組水迷宮實驗逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)評分組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 大鼠體內(nèi)磁珠病理性改變及分布情況

各組大鼠臟器形態(tài)未見明顯改變，形態(tài)正常，臟器表面光滑。經(jīng)HE染色顯微鏡下可見各臟器結構完整，臟器細胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，未見局部炎性反應；經(jīng)普魯士藍染色，氧化鐵磁珠在注入大鼠體內(nèi)5 min后已經(jīng)離開循環(huán)系統(tǒng)進入各種臟器，磁珠大部分分布在脾臟及肝臟，少量磁珠分布在肺臟，僅極少量磁珠分布在腦組織。磁珠在實驗大鼠體內(nèi)7 d時，主要臟器中沉積量達到高峰，35 d時臟器內(nèi)沉積的磁珠量減少，65 d時磁珠在體內(nèi)仍有殘留，100 d時臟器內(nèi)磁珠殘留明顯減少。見圖1～4。

2.3 家兔體內(nèi)注射氧化鐵磁珠后生化指標變化情況

較注射前，家兔體內(nèi)注射氧化鐵磁珠7 d及65 d后，ALT、AST、BUN、K、Na、CHOL、TG等指標水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），Cr則隨在不同時間點有上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但肌酐值仍在家兔血液化驗指標正常范圍內(nèi)。見表2。

2.4 家兔體內(nèi)注射氧化鐵磁珠后鐵系列指標變化情況

與注射前比較，家兔體內(nèi)注射氧化鐵磁珠7 d后血清鐵、鐵蛋白、總鐵結合力等鐵系列指標水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表3。

2.5 家兔體內(nèi)注射氧化鐵磁珠后血常規(guī)化驗值變化情況

較注射前，家兔體內(nèi)注射氧化鐵磁珠7 d及65 d后，WBC、RBC、Hb、Hct、MCV、MCH、PLT等指標水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表4。

3 討論

納米材料具有體積小、表面積高等特點，并且在傳導性、反應性、光敏性上均表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。隨著現(xiàn)代社會對納米材料的研究日漸深入，納米氧化鐵磁珠在生物醫(yī)學領域得以飛速發(fā)展，被應用于MRI對比劑、藥物載體、生物分子探針等多個領域，并在惡性腫瘤的臨床診治中發(fā)揮了重要價值。而氧化鐵作為磁性納米粒子之一，不僅有納米材料的表面效應、尺寸效應、量子效應及宏觀量子隧道效應，同時還具優(yōu)勢耐光性、抗腐蝕性及穩(wěn)定性，氧化鐵磁珠還合并磁響應性、超順磁性，并有類酶催化性、生物相容性[8-9]。陳龍華[10]通過磁共振成像觀察超順磁性氧化鐵標記脂肪干細胞在腦梗死大鼠腦內(nèi)的遷徙及分布時指出，經(jīng)超順磁性氧化鐵標記脂肪干細胞移植后可通過磁共振對其在大鼠腦內(nèi)遷徙及分布情況進行觀察；王海龍等[11]也報道將超順磁性氧化鐵作為示蹤劑，用于標記細胞可在細胞移植機制、治療效果的探索上發(fā)揮重要價值。隨著其應用范圍日漸廣闊，毒理安全性也應被重視。

既往有研究表明，納米氧化鐵進入體內(nèi)后經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，隨血液循環(huán)到達肝臟、脾臟等器官，經(jīng)由腎臟排泄，也有一部分經(jīng)紅細胞代謝后進入正常血漿鐵池，參與血紅蛋白、肌紅蛋白等合成，并影響能量代謝及造血功能[12-13]。而本研究亦顯示，注射磁珠后實驗大鼠正常生長、皮毛色澤等外觀及行為學能力未見明顯改變，磁珠主要在脾臟、肝臟中沉積，也有部分沉積在肺臟中，只有極少量磁珠分布在腦、心、腎臟中。磁珠在實驗大鼠體內(nèi)7 d時，主要臟器中沉積量達到高峰，35 d時臟器內(nèi)沉積的磁珠量減少，65 d時磁珠在體內(nèi)仍有殘留，100 d時臟器內(nèi)磁珠殘留明顯減少；且注射磁珠后實驗動物臟器大體及鏡下無明顯病理性改變，提示大粒徑磁珠未對動物生長、外觀、行為學能力造成明顯影響，對動物主要臟器結構功能均未造成明顯改變，并未在組織臟器中產(chǎn)生明顯局部炎性反應。同時，研究還顯示，注射磁珠后7 d時家兔血液生化指標、鐵系列指標、血常規(guī)化驗指標與注射磁珠前化驗結果無明顯差異，僅注射磁珠后65 d時家兔Cr與注射磁珠前化驗結果存在統(tǒng)計學差異，但肌酐值仍在家兔血液化驗指標正常范圍內(nèi)，這與既往報道相符[14-15]。

本研究也存一定局限性，如未針對不同給藥途徑、暴露途徑、表面修飾物的氧化鐵磁珠進行毒理研究，未制備急性腦梗死模型，且本研究為動物體內(nèi)實驗，還需進一步研究氧化鐵磁珠在人體內(nèi)的相關毒性[16-18]，綜合本研究結論，納米磁珠技術的毒理研究仍有極大深入探究空間[19-20]。

綜上所述，動物實驗可見，未見經(jīng)靜脈注射氧化鐵磁珠對動物生長、外觀、行為學能力及神經(jīng)功能造成明顯影響，對動物主要臟器結構功能均未造成明顯改變，并未在組織臟器中產(chǎn)生明顯局部炎性反應，血清相關指標也未見面明顯影響。

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（收稿日期：2018-05-10 本文編輯：任 念）