基于高通量測(cè)序的內(nèi)蒙古姆州諾爾鹽湖細(xì)菌群落組成分析

楊　麗, 殷婷婷, 尹　馨，顧笑赫, 溫洪宇

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州　221116)

基于高通量測(cè)序的內(nèi)蒙古姆州諾爾鹽湖細(xì)菌群落組成分析

楊麗, 殷婷婷, 尹馨，顧笑赫, 溫洪宇

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州221116)

從內(nèi)蒙古姆州(多羅)諾爾鹽湖采集鹵水樣品，提取總DNA后對(duì)其細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，通過454高通量測(cè)序，得到優(yōu)化序列9903條，共分入1325個(gè)OTU中。優(yōu)化序列經(jīng)篩選后得到8320個(gè)序列，分別歸入細(xì)菌13個(gè)門，其中變形菌門(Proteobacteria)占主要地位，占總序列數(shù)的39.39%；其次32.08%的序列歸入擬桿菌門(Bacteroidetes)。在綱水平上，所得序列分別屬于Cytophagia，γ-變形菌綱(Gamma-proteobacteria)，α-變形菌綱(Alpha-proteobacteria)和浮霉菌綱(Phycisphaerae)。屬水平上的數(shù)據(jù)表明，所得序列屬于硝化球菌屬(Nitrococcus)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、海桿菌屬(Marinobacter)、Gracilimonas、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、弧菌屬(Salinivibrio)和Salinibacter等。研究揭示了姆州諾爾鹽湖嗜鹽細(xì)菌群落組成，表明姆州諾爾鹽湖存在豐富的嗜鹽細(xì)菌資源和潛在的新類群，從而為新種的挖掘及嗜鹽菌的開發(fā)提供了理論數(shù)據(jù)。

細(xì)菌；454高通量測(cè)序；細(xì)菌群落；鹽湖；16S rRNA

我國是個(gè)多鹽湖國家，現(xiàn)約有1000個(gè)鹽湖，主要分布于內(nèi)蒙古、新疆、西藏、青海及其周邊地區(qū)[1]，其中內(nèi)蒙古鹽湖數(shù)量且分布范圍較廣。鹽湖作為高鹽濃度特殊環(huán)境，其中富含嗜鹽微生物。嗜鹽細(xì)菌是鹽湖生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，同時(shí)具有特殊的遺傳機(jī)制和特有的代謝產(chǎn)物，因此具有很大的應(yīng)用研究價(jià)值與開發(fā)前景[2～4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，內(nèi)蒙古自治區(qū)共有169個(gè)干涸或半干涸鹽湖[5]，針對(duì)其鹽湖逐漸減少的現(xiàn)狀，加快該地區(qū)對(duì)鹽湖嗜鹽微生物類群的研究具有重要意義。

盡管越來越多的嗜鹽菌被分離出來，但自然環(huán)境中僅有1%左右甚至更少的微生物具有可培養(yǎng)性[6]。因此僅僅依靠傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行研究，已滿足不了微生物資源開發(fā)和利用的發(fā)展[7]。454焦磷酸測(cè)序等高通量測(cè)序技術(shù),又被稱為第二代高通量測(cè)序技術(shù)，可以克服傳統(tǒng)方法在克隆測(cè)序方面的局限，具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、高靈敏度、快速和高自動(dòng)化的特點(diǎn)[4]，已被應(yīng)用于大量研究中[8～11]。姆州諾爾鹽湖，位于內(nèi)蒙古自治區(qū)東北部的呼倫貝爾市新巴爾虎左旗，在阿木古郎鎮(zhèn)西部。湖盆為新生代河谷侵蝕凹地或風(fēng)蝕低地，湖區(qū)依靠大氣降水與地下水補(bǔ)給。該湖屬硫酸鹽型硫酸亞鈉型，鹽類資源有石鹽和芒硝兩大類且以石鹽為主，當(dāng)?shù)啬撩駬迫∈}加工食用；與普通淡水湖及海水相比，該湖NaCl濃度極高，為63.16g/L[12]，鹽濃度適宜極端嗜鹽微生物的生長[13]，生態(tài)環(huán)境特殊。但是目前尚未見關(guān)于內(nèi)蒙古鹽湖細(xì)菌群落的報(bào)道，因此本文運(yùn)用454焦磷酸測(cè)序方法,研究姆州諾爾鹽湖嗜鹽細(xì)菌群落組成，以期為新種的發(fā)現(xiàn)和嗜鹽菌的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1采樣、DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增

于2014年8月采集姆州諾爾鹽湖鹵水樣品1000mL，用0.22μm滅菌濾膜過濾。膜剪切后，使用 OMEGA 公司 E.Z.N.A Water DNA 試劑盒抽提基因組DNA。采用引物為27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC -3′)[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 20μL反應(yīng)體系： 5 × FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mMdNTPs 2 μL，正向引物(5 μM) 0.8 μL，反向引物(5 μM) 0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10ng，最后補(bǔ) ddH2O 至20μL。

1.2高通量測(cè)序

將PCR 產(chǎn)物文庫使用Promega公司的Quanti FluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。按照測(cè)序量需要確定相應(yīng)比例進(jìn)行混合，于454/Roche GS-FLX平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序使用GS FLX +Sequencing Method Manual_XL R70Kit試劑盒。

1.3序列優(yōu)化與物種組成分析

去除所測(cè)有效序列末端接頭序列、后引物序列、多堿基N、polyA/T與低質(zhì)量序列、標(biāo)簽序列和前引物序列，得到最終優(yōu)化序列。與SILVA庫中16S核糖體序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，以16S rRNA基因序列相似度低于97%作為不同的分類單元(OTU)為標(biāo)準(zhǔn)，使用mothur軟件進(jìn)行OTU聚類分析，并構(gòu)建稀疏曲線。根據(jù)SILVA數(shù)據(jù)庫中的參考序列對(duì)OTU進(jìn)行種屬鑒定和分類學(xué)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1454測(cè)序序列數(shù)據(jù)

對(duì)姆州諾爾鹽湖鹵水樣品進(jìn)行454高通量測(cè)序，統(tǒng)計(jì)分析得出細(xì)菌有效序列數(shù)為13034條，通過序列優(yōu)化后所得的優(yōu)化序列數(shù)為9903條，占有效序列的75.98%，最終優(yōu)化序列平均長度為474bp。

2.2細(xì)菌豐度

對(duì)所有序列按照97%的相似度進(jìn)行 OTU 劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析得出，本樣品所測(cè)得序列共歸入272個(gè)OTU中。在97%相似性水平下劃分 OTU并制作的本樣品的稀疏曲線(圖1)可以看出，在所測(cè)序列數(shù)量增大的情況下，所歸類的OTU數(shù)量逐漸增大，但增大的趨勢(shì)減小，說明測(cè)序質(zhì)量較好，深度較大。

圖1　稀疏曲線Fig.1　Rarefaction curves

2.3細(xì)菌群落組成

2.3.1細(xì)菌在門水平上的群落組成

在門水平上，優(yōu)化序列經(jīng)篩選后所得的8320個(gè)序列分別歸入13個(gè)門中。由圖2可知，變形菌門(Proteobacteria)是樣品中最主要的門類，共有3277條序列，占總數(shù)的39.39%；其次2669條序列屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，占總數(shù)的32.08%；有1354條序列并未進(jìn)行分類到門，或并未發(fā)現(xiàn)，占總數(shù)的16.27%；其余稀有的門類占總數(shù)的4.23%(圖2)。

圖2　細(xì)菌群落在門水平上的分布統(tǒng)計(jì)Fig.2　Relative abundance in different phyla of the bacteria

2.3.2細(xì)菌在綱水平上的群落組成

在綱水平上，所得序列分別屬于Cytophagia，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)，浮霉菌綱(Phycisphaerae)，數(shù)量分別為2334、2230、627和423，分別占總序列數(shù)的28.05%、26.8%、7.54%、5.08%(圖3)。其中，有1907條序列并未進(jìn)行分類到綱，或并未發(fā)現(xiàn)，占序列總數(shù)的22.92%(圖3)。

圖3　細(xì)菌群落序列在綱水平的上分布統(tǒng)計(jì)Fig.3　Relative abundance in different classes of the bacteria

2.3.3細(xì)菌在屬水平上的群落組成

屬水平上的數(shù)據(jù)表明，共有6431條序列為未知序列或尚未被分類到屬，占總序列數(shù)的77.3%，說明有很多潛在新種待發(fā)現(xiàn)；其他主要有690、220、155、113、101、89和79條序列分別屬于硝化球菌屬(Nitrococcus)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、海桿菌屬(Marinobacter)、Gracilimonas、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)和弧菌屬(Salinivibrio)，分別占總序列數(shù)的8.29%、2.64%、1.86%、1.36%、1.21%和1.07%，其余稀有屬共521條序列，占序列總數(shù)6.27%(下表)。

表　細(xì)菌群落序列在屬水平的上分布統(tǒng)計(jì)

3　結(jié)果與討論

利用454高通量測(cè)序?qū)δ分葜Z爾鹽湖鹵水樣品進(jìn)行測(cè)序，統(tǒng)計(jì)分析得到細(xì)菌優(yōu)化序列為9903條，平均長度為474bp，獲得1325個(gè)OTU。細(xì)菌群落組成分析得知，優(yōu)化序列經(jīng)篩選后所得的8320個(gè)序列分別歸入13個(gè)門中，變形菌門(Proteobacteria)是樣品中最主要的門類；其次，32.08%屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)。在綱水平上，所得序列分別屬于Cytophagia，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和浮霉菌綱(Phycisphaerae)，分別占總序列數(shù)的28.05%、26.8%、7.54%、5.08%。屬水平上的數(shù)據(jù)表明，所得序列屬于硝化球菌屬(Nitrococcus)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、海桿菌屬(Marinobacter)、Gracilimonas、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、弧菌屬(Salinivibrio)和Salinibacter等，分別占總序列數(shù)的8.29%、2.64%、1.86%、1.36%、1.21%、1.07%和0.95%。

姆州諾爾鹽湖中的嗜鹽細(xì)菌類群與新疆巴里坤湖、瑪納斯湖[15]、羅布泊鹽湖[16]和達(dá)坂城鹽湖[17]比較，共有的菌群僅有嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)，且均為其優(yōu)勢(shì)菌群，說明嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)分布較廣，并且對(duì)不同的高鹽環(huán)境都具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力,反映出不同地區(qū)鹽湖中嗜鹽細(xì)菌的群落組成結(jié)構(gòu)具有一定的相似性。但新疆鹽湖中另兩個(gè)共同的優(yōu)勢(shì)菌群喜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)與芽孢桿菌屬(Bacillus)在姆州諾爾鹽湖中并未發(fā)現(xiàn)，且姆州諾爾鹽湖中還有一些獨(dú)特的類群，包括硝化球菌屬(Nitrococcus) 與海桿菌屬(Marinobacter)等。這些菌群在關(guān)于嗜鹽微生物的文獻(xiàn)中未見報(bào)道，較為獨(dú)特，也說明了姆州諾爾鹽湖生態(tài)環(huán)境的獨(dú)特性。姆州諾爾鹽湖與何敏艷等報(bào)道的連云港臺(tái)北鹽土及三圩鹽土細(xì)菌群落[18]比較發(fā)現(xiàn)，三地共有的屬為嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)，而三圩鹽土中還有兩種姆州諾爾鹽湖與臺(tái)北鹽土中并未發(fā)現(xiàn)的屬，即喜鹽芽孢桿菌(Halobacillus)和Pontibacillus。姆州諾爾鹽湖鹽濃度極高，為6.316%，臺(tái)北鹽場(chǎng)鹽田土為2.172%，而三圩鹽場(chǎng)鹽土鹽濃度為0.813%。由嗜鹽微生物劃分標(biāo)準(zhǔn)[14]可知，姆州諾爾鹽湖鹽濃度極高，適宜生長極端嗜鹽菌，而其鹽濃度對(duì)于中度嗜鹽菌等并非最適條件。有關(guān)喜鹽芽孢桿菌(Halobacillus)和Pontibacillus的研究[19～22]表明，其種主要屬于中度嗜鹽菌，因此并未在姆州諾爾鹽湖此高鹽環(huán)境下檢測(cè)到此兩種菌群。另外，姆州諾爾鹽湖樣品在各分類水平上均有大量序列屬于未知序列或未被分類的序列，對(duì)應(yīng)有可能為一些潛在的新種，因此此地區(qū)鹽湖的微生物物種資源具有很大的挖掘價(jià)值。要進(jìn)一步完善和改進(jìn)分離培養(yǎng)等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行研究，才能獲得更全面的信息。

本文通過高通量測(cè)序獲得了大量的序列，全面解析了內(nèi)蒙古姆州諾爾鹽湖中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，可為今后鹽湖細(xì)菌群落多樣性和物種分布特征的比較提供一定的理論基礎(chǔ)，也可為補(bǔ)充完善我國的高鹽環(huán)境中微生物物種資源及今后的嗜鹽菌的開發(fā)提供重要的參考。

致謝：高通量測(cè)序由上海美吉生物公司完成，特此致謝。

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Analysis on the Bacterial Community Composition of Muzhou Nuoer Salt Lake in Inner Mongolia based on High-throughput Sequencing

YANG Li,YIN Ting-ting,GU Xiao-he,WEN Hong-yu

(SchoolofLifeSciences,JiangsuNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221116,China)

Brine samples were taken from Muzhou Nuoer salt lake in Inner Mongolia, after extracting total DNA, 16S rRNA gene of the bacteria was amplified by PCR, and 454 high-throughput sequencing were used for the investigation of bacterial communities and species diversity of Muzhou Nuoer salt lake in Inner Mongolia. A total of 9903 valid reads were obtained from the brine sample, and 8320 trimmed reads were remained after trimming. 1325 operational taxonomic units (OTUs) were generated. The bacterial community in the sample was dominated by the Proteobacteria(39.39%) and Bacteroidetes(32.08%) in phylum level. The bacterial community in the sample was dominated by the Cytophagia, Gamma- proteobacteria, Alpha-proteobacteria and Phycisphaerae in class level. In genus level, the bacterial community in the sample was dominated by the Nitrococcus, Halomonas, Marinobacter, Gracilimonas, Halanaerobium, Salinivibrio and Salinibacter. The study revealed the community composition of halophilic bacteria in Muzhou Nuoer salt lake, indicating that there are abundant halobacteria resources and new species in the Muzhou Nuoer salt lake. Thus, this study could provide theoretical data for the exploration and development of new species in the future.

Bacteria; 454 pyrosequencing; bacterial community; salt lake; 16S rDNA

2015-04-22

國家級(jí)大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃要項(xiàng)目(2013103200 38)。

楊麗(1991-)，女，山西忻州人，2014年畢業(yè)于江蘇師范大學(xué)生物科學(xué)專業(yè)，主要從事環(huán)境微生物研究工作。

溫洪宇，wenhy2007@126.com。

X835

A

1001-3644(2015)06-0034-05