高鈣菜莖總黃酮提取及抗氧化活性研究

◎ 李艷紅，彭 偉，侯斯晉

（綿陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 綿陽(yáng) 621000）

高鈣菜含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)元素，胡蘿卜素、維生素B等營(yíng)養(yǎng)素[1]，以及生物堿、黃酮類化合物、β-谷甾醇、沒(méi)食子酸等功能因子[2-3]，具有較好等抗氧化性、抗炎癥、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等生物活性[4]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于高鈣菜的研究報(bào)道主要集中在高鈣菜葉化學(xué)成分的分析、高鈣菜總黃酮的提取工藝研究、高鈣菜總黃酮的分離純化以及抗氧化活性研究[5-7]，而且原料大多來(lái)自華東、華中、華南（如安徽、湖北）等地。由于高鈣菜除了嫩尖，還有大量的莖，尤其是在大量種植未及時(shí)采摘，由于高鈣菜生長(zhǎng)旺盛，會(huì)有大量莖產(chǎn)生，單純丟棄會(huì)造成資源大量浪費(fèi)。本文主要研究高鈣菜莖總黃酮的提取與抗氧化活性，以期為合理利用該部分資源提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高鈣菜，2017年8月采自西南科技大學(xué)蔬菜實(shí)驗(yàn)園，新鮮，無(wú)蟲(chóng)害。

試劑：蘆丁對(duì)照品，南京替斯艾么中藥研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基 -苯并噻唑 -6-磺酸 )二銨鹽（ABTS），SIGMA ALDRICH公司；乙醇、等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900H型紫外分光光度計(jì)，Hitachi日立公司；Agilent1200 系列LC-MS；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；冷凍真空干燥儀，Thermo Electron Corporation。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高鈣菜莖總黃酮提取工藝

高鈣菜→去葉留莖→清洗→沸水燙漂30 s→55 ℃烘干→粉碎→過(guò)60目篩，作為樣品原料→總黃酮提取（料液比1∶50，提取溫度85 ℃，提取時(shí)間4 h，乙醇濃度80%）→離心（4 500 r/min，15 min）→上清液備用。

1.3.2 總黃酮測(cè)定與得率計(jì)算

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用NaNO2-Al(NO3)3法[8]測(cè)定總黃酮含量，以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度對(duì)吸光值進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得回歸方程為y=1.000 6x+0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/mL），y為吸光度。

1.3.2.2 樣品總黃酮含量測(cè)定

取總黃酮待測(cè)液1.0 mL于25 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法加入待測(cè)試劑并測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮得率。

1.3.3 總黃酮抗氧化活性研究

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

以無(wú)水乙醇作為參比，參考Helal A等[9]的方法，并略加修改。向比色管中依次加入1 mL不同濃度樣液、2 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，搖勻，室溫黑處?kù)o置30 min，在517 nm處測(cè)定不同時(shí)間各濃度樣品溶液的吸光值A(chǔ)i；分別以等體積去離子水代替DPPH自由基和樣品溶液，分別測(cè)定吸光值A(chǔ)j和Ac。按下式計(jì)算DPPH·清除率（K）。

1.3.3.2 超氧陰離子自由基清除活性

參照鄰苯三酚自氧化法[9]，并略加修改。在0～180 s內(nèi)，每30 s在波長(zhǎng)319.5 nm處測(cè)定一次吸光值。將測(cè)量值帶入式（2）計(jì)算：

式（2）中：?Ai是加入樣品溶液吸光值隨時(shí)間的變化率；?Aj是不加顯色劑溶液體系吸光值隨時(shí)間的變化率；?Ac是不加樣液溶液體系的吸光值隨時(shí)間的變化率。

1.3.3.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

參考Helal A等[9]的方法，并略加修改。在25 mL比色管中依次加入40 μL不同濃度試樣及4 mL ABTS陽(yáng)離子自由基（ABTS+·）測(cè)定液，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，于734 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i。以去離子水代替ABTS+·測(cè)定液，測(cè)定Aj，再以去離子水代替樣液，測(cè)定Ac。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，作圖主要由Excel2013軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鈣菜總黃酮得率

在料液比1∶50，提取溫度85℃，提取時(shí)間4 h，乙醇濃度80%條件下，高鈣菜莖總黃酮得率（1.64±0.12）%。

2.2 DPPH自由基清除活性

高鈣菜莖總黃酮、丁基羥基茴香醚（BHA）和VC對(duì)DPPH·的清能力結(jié)果，如圖1所示。

圖1 總黃酮對(duì)DPPH·的清除活性圖

由圖1可知，高鈣菜莖總黃酮和VC對(duì)DPPH·的清除率均高于BHA。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)抗氧化劑濃度在38.4 μg/mL以下時(shí)，莖總黃酮對(duì)DPPH·的清除率幾乎呈線性變化，當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，DPPH·清除率增幅平緩接近于100%。莖總黃酮、BHA、VC清除DPPH·的 IC50值分別為 15.67 μg/mL、40.80 μg/mL、14.43 μg/mL，3種試樣清除DPPH·能力大小排序?yàn)椋篤C＞莖總黃酮＞BHA。說(shuō)明高鈣菜莖總黃酮對(duì)DPPH·有良好的清除作用，與VC能力相當(dāng)。

2.3 超氧陰離子自由基清除活性測(cè)定

高鈣菜莖總黃酮、BHA和VC對(duì)超氧陰離子自由基清能力結(jié)果，如圖2所示。

圖2 不同抗氧化劑對(duì)超氧陰離子自由基清除活性圖

由圖2可知，隨著試樣濃度的增大，3種抗氧化劑對(duì)超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高，但VC對(duì)超氧陰離子自由基清除率快速增加至100%，而莖總黃酮和BHA對(duì)超氧陰離子自由基清除率增幅較小，在221 μg/mL時(shí)，莖總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除率接近于BHA；莖總黃酮、BHA、VC清除超氧陰離子自由基的 IC50值分別為：117.01、144.91、55.65 μg/mL，超氧陰離子自由基清除能力大小依次為VC＞莖總黃酮＞BHA。說(shuō)明高鈣菜莖總黃酮對(duì)超氧陰離子有較好的清除作用。

2.4 ABTS+自由基清除活性測(cè)定

高鈣菜莖總黃酮、BHA和VC對(duì)ABTS+自由基清能力結(jié)果，如圖3所示。

圖3 不同抗氧化劑對(duì)ABTS+自由基清除活性圖

由圖3可知，隨著試樣濃度的增大，3種抗氧化劑對(duì)ABTS+自由基的清除率呈線性增加，莖總黃酮清除ABTS+自由基能力在各個(gè)濃度下均高于VC和BHA，莖總黃酮、BHA、VC清除ABTS+自由基的IC50值分別 為：125.87 μg/mL、175.20 μg/mL、221.29 μg/mL，3種試樣對(duì)ABTS+自由基清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋呵o總黃酮＞BHA＞VC。說(shuō)明莖總黃酮對(duì)ABTS+自由基有良好的清除作用。

3 結(jié)語(yǔ)

高鈣菜莖總黃酮得率為（1.64±0.12）%。當(dāng)高鈣菜莖總黃酮濃度在38.4 μg/mL以上時(shí)，高鈣菜莖總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力與VC相當(dāng)，達(dá)100%，明顯高于BHA；隨著試樣濃度的增大，VC對(duì)超氧陰離子自由基清除率快速增加至100%，而莖總黃酮和BHA對(duì)超氧陰離子自由基清除率增幅較小，在濃度為221 μg/mL時(shí)，莖總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除率接近BHA，達(dá)74.29%；VC、BHA和莖總黃酮隨著試樣濃度的增加對(duì)ABTS+自由基的清除率呈線性增加，莖總黃酮清除ABTS+自由基能力在各個(gè)濃度下均高于VC和BHA。