實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在石蠟包埋組織中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)意義

張美蘭，沈哲式，張英哲，金仁順

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，吉林 延吉 133000)

結(jié)核病(tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性肉芽腫性病，以肺結(jié)核病最為常見，但亦見于全身各臟器和器官，危害性極大。雖然近年國(guó)內(nèi)部分省結(jié)核病得到有效的控制，呈穩(wěn)定下降趨勢(shì),但我國(guó)還是全球結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一[1-4]。為了促進(jìn)我國(guó)結(jié)核病病理學(xué)診斷水平，2017年中華醫(yī)學(xué)會(huì)提出了“中國(guó)結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識(shí)”。共識(shí)提出了結(jié)核病的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，即在結(jié)核病基本病理變化的基礎(chǔ)上，結(jié)核分枝桿菌基因檢測(cè)陽(yáng)性才能做出明確的結(jié)核病診斷[5]。結(jié)核病的分子病理學(xué)檢測(cè)方法有多種，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)方法已被廣泛利用于臨床[6-8]，但檢測(cè)痰、血液、胸腹腔積液和腦脊液等標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性率較低。本試驗(yàn)對(duì)組織學(xué)上診斷為結(jié)核病以及伴有壞死、肉芽腫但不能明確診斷結(jié)核病的石蠟包埋組織標(biāo)本，采用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行結(jié)核桿菌核酸檢測(cè)，與抗酸染色的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討FQ-PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源： 選擇2014年5月～2017年11月間我院手術(shù)切除、手術(shù)活檢和穿刺活檢，并在病理科進(jìn)行常規(guī)切片染色后診斷為結(jié)核病的87例及伴有少量壞死和肉芽腫性炎，但在組織學(xué)上不足診斷結(jié)核病的病例58例做對(duì)照，具體的標(biāo)本來源見表1。145例中男77例，女68例，對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)，其中對(duì)49例同時(shí)做抗酸染色進(jìn)行對(duì)比。

1.2FQ-PCR結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法：將石蠟包埋組織切8～10片，厚度為5～10 μl，放入離心管中加入1 ml二甲苯脫蠟，加入1ml無(wú)水乙醇離心進(jìn)行脫水，之后加入20 μl蛋白酶K提取石蠟包埋組織中的DNA；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)體系為40 μl：TB PCR反應(yīng)液37.8ul，Taq酶0.2 μl，UNG 0.06 μl，樣本2 μl。循環(huán)條件：37℃，5 min；94℃，1 min；95℃，5 sec；60℃，30 sec，40個(gè)循環(huán)。

1.3結(jié)果判讀：檢測(cè)樣本Ct值為40，0或無(wú)數(shù)值報(bào)告為陰性，見圖1；檢測(cè)樣本Ct值≤37.0，且有典型的S型曲線，為陽(yáng)性，見圖2；檢測(cè)樣本Ct值>37.0重新檢測(cè)，若樣本Ct值<40可報(bào)告為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4抗酸染色：石蠟組織3～4 μm厚切片，用汽油松節(jié)油脫蠟，按照試劑盒說明進(jìn)行染色，陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)核分枝桿菌呈紅色，長(zhǎng)約3 μm，呈纖細(xì)而微彎的桿狀物或串珠狀物，也可以長(zhǎng)或較短粗，散在或成堆排列，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色，在高倍鏡下觀察全部切片，未發(fā)現(xiàn)者判為陰性，找到>3條判為陽(yáng)性。

表1145例標(biāo)本來源及病理診斷為結(jié)核病的87例FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果[例(%)]

部位總例數(shù)結(jié)核例數(shù)陽(yáng)性陰性肺及胸壁605044(88.0)6(12.0)淋巴結(jié)1676(85.7)1(14.3)鼻咽、扁桃體974(57.1)3(42.9)附睪,腎1265(83.3)1(26.7)腸、大網(wǎng)膜1363(50.0)3(50.0)子宮、乳腺633(100.0)0(0.0)皮下組織1500(0.0)15(0.0)其他1485(62.5)3(37.5)合計(jì)1458770(80.5)17(19.5)

注：其他部位包括涎腺、腹腔、盆腔、脾臟、前列腺等

圖1 TB-DNA 陰性曲線

圖2 TB-DNA 陽(yáng)性曲線

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在145例檢測(cè)標(biāo)本中74例FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，占51%，在組織學(xué)上診斷為結(jié)核病的87例中70例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為80.5%(70/87)，其中肺及胸壁陽(yáng)性率最高(62.9%)，其次是淋巴結(jié)(8.6%)，見表1，在組織學(xué)上無(wú)足夠證據(jù)診斷結(jié)核，考慮為慢性潰瘍，結(jié)節(jié)病和慢性肉芽腫性炎的4例，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性。同時(shí)進(jìn)行抗酸染色的49例標(biāo)本中，單純抗酸染色陽(yáng)性者14例，占28.6%，其陽(yáng)性率明顯低于FQ-PCR染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，兩種檢測(cè)方法同時(shí)陽(yáng)性者9例，占78.5%，有較高的一致性。見表2、3。

表2FQ-PCR及抗酸染色檢測(cè)結(jié)果(例)

臨床診斷例數(shù)FQ-PCR + - 例數(shù)抗酸染色 + - 結(jié)核877017321121非結(jié)核5845417314合計(jì)1457471491435

表3抗酸染色與 PCR檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系(例)

抗酸染色FQ-PCR 陽(yáng)性 陰性 合計(jì)陽(yáng)性113 14陰性211435合計(jì)321749

3 討論

近年我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率穩(wěn)步下降，但肺結(jié)核患者數(shù)仍居全球第二位[4]。臨床常用的結(jié)核病原體檢查方法是痰、胸腹水、血液中的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，敏感度低。在組織學(xué)上典型的結(jié)核病易診斷，但隨著非結(jié)核分枝桿菌的感染率上升及不典型結(jié)核病變以及耐藥結(jié)核病患者增加[9]，有時(shí)單靠組織學(xué)特征診斷困難。

本文選擇在組織學(xué)上診斷為結(jié)核病的87例蠟塊組織，進(jìn)行FQ-PCR法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70例呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為80.5%，在陽(yáng)性標(biāo)本中肺和胸膜組織最多，其陽(yáng)性率也最高，其次是淋巴結(jié)、鼻咽和扁桃體等，提示肺結(jié)核病為最常見。近年隨著支氣管鏡的廣泛開展，肺黏膜活檢越來越多，因此，在肺活檢標(biāo)本中結(jié)核病檢出率越來越高[10]，本組FQ-PCR法檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中有11例為肺活檢標(biāo)本，部分病例在組織學(xué)上僅見少量類上皮樣細(xì)胞及小的結(jié)核樣結(jié)節(jié)，但FQ-PCR法檢測(cè)均為陽(yáng)性，因此，認(rèn)為FQ-PCR檢測(cè)方法敏感性高，尤其對(duì)小標(biāo)本的檢測(cè)值得臨床推廣。近年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)喉、扁桃體等開放性臟器的結(jié)核病，但這些部位的結(jié)核病臨床癥狀不典型，取活檢困難，標(biāo)本小，有時(shí)在傳統(tǒng)的HE染色上病變不典型診斷更困難。本組中7例疑結(jié)核病的扁桃體、喉和會(huì)厭活檢小標(biāo)本中4例為陽(yáng)性，最后可以明確結(jié)核病的診斷。

抗酸染色作為病理診斷的輔助檢查方法已廣泛應(yīng)用于臨床，但有局限性。此染色不僅結(jié)核分枝桿菌呈陽(yáng)性，而非結(jié)核分枝桿菌如麻風(fēng)桿菌也呈陽(yáng)性。另外，因桿菌較小在鏡下觀察有一定的難度，并具有觀察者的主觀差異，尤其是活檢小標(biāo)本菌量少的易漏診[10]。本文中筆者對(duì)49例同時(shí)進(jìn)行抗酸染色和FQ-PCR檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TB-DNA陽(yáng)性率明顯高于抗酸染色，提示FQ-PCR檢測(cè)石蠟組織中的結(jié)核桿菌具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，優(yōu)于抗酸染色，并可以區(qū)分結(jié)核桿菌與非結(jié)核桿菌，提高結(jié)核桿菌的檢出率[6-8，10]。本組中2例肺組織和1例胸膜組織抗酸染色陽(yáng)性，但FQ-PCR陰性，其可能原因是：①可能其他抗酸染色陽(yáng)性的分枝桿菌感染；②活檢小標(biāo)本因組織過小、組織較大的蠟塊在切取蠟塊組織時(shí)修片過多，導(dǎo)致在FQ-PCR檢測(cè)用的組織片里沒有病變組織；③FQ-PCR操作原因：在核酸提取過程中，因組織小丟失DNA、提取不純、或抑制物影響擴(kuò)增等原因均可導(dǎo)致假陰性。通過本研究筆者認(rèn)為對(duì)小活檢或穿刺標(biāo)本石蠟不要進(jìn)行修片，盡可能提高模板DNA的含量；對(duì)組織較大的蠟塊標(biāo)本，對(duì)照常規(guī)HE染色進(jìn)行修片，以便提高陽(yáng)性率。

綜上所述，利用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)石蠟組織中的結(jié)核分枝桿菌，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但也可能存在假陰性，因此，應(yīng)在病理形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合抗酸染色，嚴(yán)格遵守FQ-PCR操作規(guī)范，以便提高結(jié)核分枝桿菌檢出率及診斷率。