12種真菌鉀離子通道蛋白生物信息學(xué)分析

周 威,辛董董,趙巖巖,胡梁斌,莫海珍,李紅波

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

真菌作為真核生物中一個龐大的類群,與人們的生活有著密切關(guān)系。香菇、木耳等大型真菌是人類的重要食物來源,米曲霉、釀酒酵母等是食品工業(yè)生產(chǎn)中重要的發(fā)酵菌種[1]。而黃曲霉、禾谷鐮刀菌等病原性真菌卻侵染糧食作物,危害食品安全、甚至人類健康[2-3]?？拐婢幬锎罅渴褂脦碚婢退幮匀找鎳?yán)重,了解真菌耐藥性機(jī)制、尋找新的抑制靶點(diǎn)有著重要的意義[4-5]。細(xì)胞內(nèi)K+穩(wěn)態(tài)是多數(shù)生物代謝機(jī)制和綜合性能優(yōu)化運(yùn)行的先決條件。胞內(nèi)K+動態(tài)平衡由細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上的許多K+通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所調(diào)控[6]。在孢子萌發(fā)早期階段,膜通透性增加,導(dǎo)致孢子內(nèi)離子和水重新分配,孢子內(nèi)80%的K+快速釋放到孢子外,隨后K+依賴能量被再次吸收[7]。而離子的移動往往涉及到離子通道的響應(yīng),這也是細(xì)胞識別外界信號的一個重要途徑。鉀離子通道蛋白在不同的真菌中分布廣泛,目前已在釀酒酵母、米曲霉、煙曲霉等真菌中發(fā)現(xiàn)許多鉀離子通道蛋白。鉀離子通道是離子通道中種類最多。鉀離子通道是目前存在最廣泛且最復(fù)雜的

一大類鉀離子通道,與多種生命活動密切相關(guān),是藥物設(shè)計(jì)的重要靶標(biāo)之一[8]。對于鉀離子通道結(jié)構(gòu)和功能的研究主要通過實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行的,比如人工膜離子通道重建技術(shù)、細(xì)胞膜片鉗和單通道記錄技術(shù)、通道蛋白分離、基因重組技術(shù)、純化等生化技術(shù)。在理論方面,對鉀離子通道的研究主要有動力學(xué)模擬方法和序列分析方法。目前關(guān)于真菌的鉀離子通道蛋白,研究較少。Gobert等[9]通過敲除和過表達(dá)擬南芥中鉀離子通道TPK1,發(fā)現(xiàn)TPK1對保持胞內(nèi)K+動態(tài)平衡起著重要作用,能夠影響種子的萌發(fā)、生長和氣孔運(yùn)動。敲除擬南芥花粉管K+通道AKT6后,花粉管萌發(fā)率與野生型相比大幅度降低,并且AKT6對外界pH變化非常敏感[10]。隨著對K+通道的研究,尚有一些問題有待深入探討,比如亞基的功能、基因突變與疾病的不一致性等。由于K+通道自身的復(fù)雜性和多樣性使得對一些K+結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識上存在一定的局限性。多學(xué)科交叉研究和先進(jìn)的技術(shù)方法的使用,對于探討某些疾病或狀態(tài)的機(jī)制、早期診斷及發(fā)現(xiàn)特異性治療藥物或措施等均具有十分重要的理論和實(shí)際意義[11]。

利用生物信息學(xué)對蛋白進(jìn)行序列分析,從而推斷并預(yù)測其結(jié)構(gòu)和功能,已成為初步確定基因結(jié)構(gòu)及功能的一種捷徑[12]。本文篩選了釀酒酵母、黃曲霉、煙曲霉、禾谷鐮刀菌、玉米黑粉菌、布拉克須霉等12種真菌的鉀離子通道蛋白,采用生物信息學(xué)分析了這些蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化等,以期為真菌鉀離子通道蛋白結(jié)構(gòu)與生理功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12種真菌釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、玉米黑粉菌(A.flavus)、布拉克須霉(Phycomycesblakesleeanus)等。

NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

從NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查找12種真菌鉀離子通道蛋白的氨基酸序列(表1)。

表1 12種真菌鉀離子通道氨基酸和核苷酸序列號Table 1 Amino acid and nucleotide sequence number of 12 fungal potassium channel proteins

利用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析核酸及氨基酸序列的組成成分及理化性質(zhì)。采用CLCCombinedWorkbench6觀察圖形化的多重序列比對結(jié)果。采用WebLogo產(chǎn)生序列l(wèi)ogo圖譜[13]。利用ClustalX1.83和MEGA6.0.5軟件對12種真菌鉀離子通道氨基酸和核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[14]。利用NPS分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[15]。利用SWISS-MODEL分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)[16]。

利用HOMCOS進(jìn)行同源四聚體結(jié)構(gòu)模擬。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

應(yīng)用多序列比對工具ClustalX1.83,以氨基酸全序列聯(lián)配的結(jié)果為基礎(chǔ),用MEGA6.0.5軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,通過隨機(jī)逐步比較的方法搜索最佳系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌鉀離子通道蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線工具分析釀酒酵母、黃曲霉、煙曲霉、禾谷鐮刀菌、玉米黑粉菌、布拉克須霉等12種真菌鉀離子通道蛋白的核苷酸及其氨基酸序列。結(jié)果表明(見表2),氨基酸序列長度在659～928 aa之間,分子量在73970.53～101330.60 Da之間,理論等電點(diǎn)在5.45～9.54之間,亞細(xì)胞定位分析表明真菌鉀離子通道蛋白主要定位在質(zhì)膜、液泡上。親水性/疏水性分析顯示疏水區(qū)域明顯大于親水區(qū)域,說明真菌鉀離子通道蛋白親水性較強(qiáng),為親水性蛋白。蛋白磷酸化位點(diǎn)分析表明,不同真菌鉀離子通道蛋白具有3～18個絲氨酸位點(diǎn),其中多數(shù)蛋白具有相對保守的3個絲氨酸位點(diǎn)。

表2 12種真菌鉀離子通道蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physical and chemical properties of 12 fungal potassium channel proteins

2.2 真菌鉀離子通道蛋白同源性比較

利用NCBI Blast程序?qū)x取的12種不同真菌鉀離子通道蛋白序列進(jìn)行同源性比對。結(jié)果表明,米曲霉菌鉀離子通道蛋白(XP_001821104.1)與黃曲霉菌(XP_002376854.1)的同源性最高達(dá)99.85%,與黑曲霉菌(XP_001393797.2)、煙曲霉菌(XP_752795.1)的同源性為59.37%,與擴(kuò)展青霉(XP_016598289.1)的同源性為51.69%,與油菜莖基潰瘍病菌(XP_003842737.1)的同源性為38.13%,與灰葡萄孢菌(EMR91056.1)的同源性為36.43%,與禾谷鐮刀菌(XP_011328543.1)的同源性為27%,與釀酒酵母(CAA64176.1)的同源性為19.54%,與玉米曲霉菌(XP_001821104.1)的同源性為15.36%,與布拉克須霉(XP_018296227.1)的同源性為15.04%,與長雌異水霉(KNE72472.1)的同源性為13.59%。

采用CLC Combined Workbench 6觀察圖形化的多重序列比對結(jié)果(圖1),證實(shí)了上述同源性比對的結(jié)果。WebLogo基于多序列比對信息,把多序列的保守信息通過圖形表示出來。每個logo由一系列氨基酸組成,在每一個序列位置上用總高度表示此位置上的序列保守性,用氨基酸字母的高度表示出現(xiàn)的頻率[17]。分析表明不同真菌鉀離子通道蛋白具有特殊的鉀離子選擇器保守結(jié)構(gòu)TXGYGD(圖2)。

圖1 12種真菌鉀離子通道蛋白氨基酸序列對比Fig.1 Alignment of potassium channel proteins amino acid sequences in 12 kinds of fungal

圖2 12種真菌鉀離子通道蛋白氨基酸序列Logo圖譜Fig.2 The sequence logos of potassium channel proteins in 12 kinds of fungal by Web Logo

2.3 真菌鉀離子通道蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

真菌鉀離子通道蛋白主要采用多序列比對工具ClustalX1.83和MEGA6.0.5軟件。是以氨基酸全序列聯(lián)配的結(jié)果為基礎(chǔ),采用軟件中的MEGA6.0.5鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。對上述12種真菌鉀離子通道蛋白氨基酸序列通過隨機(jī)逐步比較的方法，搜索最佳系統(tǒng)進(jìn)化樹,對生成的系統(tǒng)樹進(jìn)行Bootstrap校正。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,采用默認(rèn)參數(shù)。結(jié)果表明(圖3),分屬于擔(dān)子菌門、子囊菌門、結(jié)合菌門以及壺菌門的各類真菌鉀離子通道蛋白能夠分別聚類在一起。其中,米曲霉(A.oryzae,XP_001821104.1)和黃曲霉(A.flavus,XP_002376854.1)在同一個進(jìn)化分支上,同源性最高,其次為黑曲霉,這與同源性比較的結(jié)果相一致。

圖3 12種真菌鉀離子通道蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 The phylogenetic analysis of potassium channel proteins in 12 kinds of fungal

2.4 真菌鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子的多肽鏈通常在一級結(jié)構(gòu)的氨基酸折疊盤曲成比較穩(wěn)定的,才能進(jìn)一步完成具有蛋白質(zhì)活性的三級或四級構(gòu)象,以完成特定的生命活動。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)通常由α-螺旋、β-折疊、γ-轉(zhuǎn)角、延伸鏈及無規(guī)則卷曲等組件組成。真菌鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)主要是通過NPS程序?qū)?2種真菌鉀離子通道蛋白序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析表明,真菌鉀離子通道蛋白均由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)元件組成,其中螺旋所占比例最高,在40.92%～52.24%之間,其次為無規(guī)則卷曲或延伸鏈(表3)。在不同真菌鉀離子通道蛋白中,上述3種元件的比例和分布存在差異,例如,米曲霉的α-螺旋占 44.87%,延伸鏈占13.97%,無規(guī)則卷曲占41.16%,這暗示鉀離子通道蛋白在不同真菌中可能具有獨(dú)特的功能。

表3 12種真菌鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Table 3 The secondary structure analysis of 12 fungal potassium channel proteins

2.5 真菌鉀離子通道蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要是指在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)之上,經(jīng)過再一次的充分折疊形成一個球形、包裹緊密、已經(jīng)具有生物活性的完整三維立體結(jié)構(gòu),即天然構(gòu)想[18]。利用Swiss-Model采用同源建模的方法預(yù)測不同真菌鉀離子通道蛋白的三級結(jié)構(gòu)。從圖4可以看出,三級結(jié)構(gòu)主要是由螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等二級結(jié)構(gòu)元件組成,其空間結(jié)構(gòu)高度相似,具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征,表明它們可能具有相似的生物學(xué)功能。鉀離子通道蛋白在活體膜中通常以四聚體結(jié)構(gòu)存在,本文以黃曲霉菌鉀離子通道蛋白(XP_002376854.1)為例,利用HOMCOS進(jìn)行同源四聚體結(jié)構(gòu)模擬,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其符合鉀離子通道結(jié)構(gòu)特征,詳見圖5。不同真菌鉀離子通道蛋白單體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和聚角度也存在差異,表明每種真菌鉀離子通道蛋白可能具有自己獨(dú)特的功能。

圖4 12種真菌鉀離子通道蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析Fig.4 The tertiary structure analysis of potassium channel proteins in 12 kinds of fungal

圖5 黃曲霉菌鉀離子通道蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析Fig.5 The tertiary structure analysis of potassium channel proteins in A.flavus

3 結(jié)論

本研究選擇12種真菌鉀離子通道蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。一般認(rèn)為,蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定二級結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu)決定三級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象多樣性導(dǎo)致了不同的生物對環(huán)境適應(yīng)性的不同。序列分析發(fā)現(xiàn)其都具有的保守結(jié)構(gòu)域保守結(jié)構(gòu)TXGYGD,屬于鉀離子通道鉀離子選擇器典型的特征片段。由二級結(jié)構(gòu)分析表明,真菌鉀離子通道蛋白均主由螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)元件組成,但不同真菌中不同元件的比例和分布存在差異,這暗示鉀離子通道蛋白在不同真菌中雖然具有相似的功能,但每種真菌的鉀離子通道蛋白可能具有自身獨(dú)特的功能。三維結(jié)構(gòu)分析表明,黃曲霉菌鉀離子通道蛋白在活體膜中是以四聚體結(jié)構(gòu)存在的,這一結(jié)構(gòu)對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能行使的正確性有重要作用。蛋白質(zhì)磷酸化是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一,可有效調(diào)控蛋白質(zhì)活力和功能,并在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。研究表明,磷酸化是真菌鉀離子通道蛋白活性調(diào)節(jié)的一種重要方式,很多真菌鉀離子通道蛋白在生物體內(nèi)都會發(fā)生磷酸化,而本研究中的磷酸化位點(diǎn)分析表明主要分布在絲氨酸上,絲氨酸位點(diǎn)一般3～18個。多個磷酸化位點(diǎn)的存在可能在植物脅迫和亞細(xì)胞定位中起著重要作用,可增強(qiáng)真菌鉀離子通道蛋白調(diào)控途徑的多樣性。

然而關(guān)于真菌鉀離子通道的相關(guān)文獻(xiàn)較少,真菌孢子萌發(fā)過程中是否涉及到鉀離子通道更是尚無研究報道。通過解析真菌鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能,可以更加深入地了解其在真菌生長發(fā)育侵染等過程中的作用機(jī)制,為病原性真菌的防治提供新的思路。