核桃根際溶磷菌的篩選

李詩(shī)娟，宋祖文，王 麗*，黃仲華，盛玉珍,金開(kāi)銘,張 玲,徐 磊

(1四川省林業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610081；2 喜德縣林業(yè)局，四川 喜德 616750;3.四川林業(yè)宣傳中心，四川 成都 610000)

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨著化肥長(zhǎng)期使用，甚至過(guò)量使用，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降、肥料利用率低、土壤板結(jié)和地下水污染等問(wèn)題。因此，國(guó)內(nèi)外都在積極尋求發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，提倡生產(chǎn)安全、無(wú)公害綠色食品。綠色食品生產(chǎn)過(guò)程中，要求不用或盡量少用化學(xué)肥料。而微生物菌肥是利用微生物生命活動(dòng)導(dǎo)致作物獲得特定肥料效應(yīng)的一種肥料，具有營(yíng)養(yǎng)全面、肥效持久、可改善作物品質(zhì)、提高肥料利用率、改良土壤結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)[1,2]。因此微生物肥料是實(shí)行綠色農(nóng)業(yè)的重要技術(shù)保證。

微生物功能菌作為微生物肥料的核心部分，是微生物肥料生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。溶磷菌是一種重要的土壤功能菌，主要為農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育提供磷元素，植物細(xì)胞中細(xì)胞膜主要由脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和糖類(lèi)組成，其中脂類(lèi)約為50%，而脂類(lèi)的主要成分為磷脂和膽固醇，由此可見(jiàn)磷元素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起重要作用；磷還參與植物生命過(guò)程的光合作用，糖和淀粉的利用和能量的傳遞過(guò)程。磷肥還能促進(jìn)植物苗期根系的生長(zhǎng)，使植物提早成熟。植物在結(jié)果時(shí)，磷大量轉(zhuǎn)移到籽粒中，使得籽粒飽滿。農(nóng)作物缺磷時(shí)生長(zhǎng)緩慢、矮小瘦弱、直立、分枝少，葉小易脫落；色澤一般，呈暗綠或灰綠色，葉緣及葉柄常出現(xiàn)紫紅色;根系發(fā)育不良，成熟延遲，產(chǎn)量和品質(zhì)降低。我國(guó)有約75%的土壤缺磷，且土壤中95%以上的磷都難以被植物直接吸收[3]。從20世紀(jì)70年代我國(guó)開(kāi)始大量使用磷肥，然而約70%的磷肥轉(zhuǎn)化為Ca-P，F(xiàn)e-P等難以被植物吸收利用的形態(tài)固定在土壤中[4,5]，溶磷菌可以將土壤中的固定態(tài)磷轉(zhuǎn)化成有效磷，因此合理利用溶磷菌與開(kāi)發(fā)微生物菌肥對(duì)提高作物產(chǎn)量、減少化肥使用、降低環(huán)境污染有巨大前景。

1 實(shí)驗(yàn)材料

土壤樣品：取自四川廣元市朝天區(qū)蒲家鄉(xiāng)河壩場(chǎng)村核桃種植園的核桃根際土壤。

培養(yǎng)基：Pikovskava無(wú)機(jī)解磷培養(yǎng)基[6]：葡萄糖10.0 g、酵母膏0.4 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3(PO4)210 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌19 min。

菌株：對(duì)照菌株：熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens) Asl.0867由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供。

菌肥菌劑：從廣州微元生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)溶磷菌菌劑分離得到菌肥1溶磷菌，從成都蓋爾蓋司生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)的菌肥中分離出一株溶磷菌：菌肥2溶磷菌。

實(shí)驗(yàn)儀器：生物安全柜，生化培養(yǎng)箱，高速梯度PCR儀，恒溫培養(yǎng)箱，分光光度計(jì)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)菌種篩選：以Pikovskava無(wú)機(jī)解磷培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基，采用平板分離和劃線純化，從土壤和菌肥菌劑中分離得到溶磷菌。

(2)溶磷菌活力測(cè)定：在100 mL三角瓶中加入30 mL Pikovskava無(wú)機(jī)解磷培養(yǎng)基，121 ℃滅菌19 min，無(wú)菌操作，每瓶接入待測(cè)菌種2 mL，并作一不接菌的空白對(duì)照，均于30 ℃，160 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)7 d 后，取上清液測(cè)有效磷。

(3)菌種鑒定：鑒于分離得到的較高效溶磷菌和菌肥溶磷菌均為細(xì)菌，采用16SrRNA/rDNA序列測(cè)序做分子鑒定，用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，細(xì)菌用16SrDNA擴(kuò)增引物(正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司純化測(cè)序。將所獲得的序列在國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)中進(jìn)行同源序列的搜索，比較供試菌株與已知菌種模式菌株相應(yīng)序列的相似度，對(duì)其做出鑒定。

(4)溶磷條件優(yōu)化試驗(yàn)。以Pikovskava無(wú)機(jī)解磷培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)發(fā)酵溫度和初始pH值進(jìn)行優(yōu)化，①確定適宜溫度范圍：將接種后的發(fā)酵液分別置于16 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃條件下，轉(zhuǎn)速160 r·min-1發(fā)酵7 d，測(cè)發(fā)酵液有效磷含量；②確定適宜初始pH值的范圍：分別配置pH值為5、6、7、8、9、10的Pikovskava無(wú)機(jī)解磷培養(yǎng)基，接種后置于30 ℃，轉(zhuǎn)速160 r·min-1條件下發(fā)酵7 d，測(cè)發(fā)酵液有效磷含量。

(5)培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)。①適宜碳源選擇：分別用乙酸銨、草酸銨、淀粉、甘露醇、蔗糖、麩皮、甘油代替原培養(yǎng)基中的葡萄糖，接種和發(fā)酵條件不變，測(cè)定其溶磷能力；②適宜氮源選擇：分別用氯化銨0.405 g·L-1、草酸銨0.538 g·L-1、尿素0.227 g·L-1、蛋白胨0.884 g·L-1、硝酸銨0.364 g·L-1代替原培養(yǎng)基中的硫酸銨，發(fā)酵5 d，接種和其他發(fā)酵條件不變，測(cè)定其溶磷能力；③金屬離子對(duì)發(fā)酵的影響：在Pikovskava解無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中分別加入CuS04·5H20 6.250 g·L-1、ZnS04·7H20 7.175 g·L-1、Fe2(SO4)39.965 g·L-1、CaCl22.775 g·L-1、MnSO4·H2O 4.225 g·L-1、NiSO4·6H2O 6.571 g·L-1的不同液體培養(yǎng)基，使其中金屬離子Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+、Mn2+、Ni2+濃度均為0.025 mol·L-1，調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基的pH值為7.0，接種和發(fā)酵條件不變，測(cè)定其溶磷能力。

3 結(jié)果與分析

3.1 溶磷菌分離純化及活性測(cè)定

利用Pikovskava無(wú)機(jī)解磷平板培養(yǎng)基，從不同的土壤樣品中篩選純化出9株溶磷微生物，其中6株細(xì)菌，編號(hào)分別為Rpx1、Rpx2、Rpx3、Rpx4、Rpx5、Rpx6；3株真菌，編號(hào)為Rpm7、Rpm8、Rpm9；通過(guò)液體發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定它們的溶磷活力，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1溶磷菌活力比較

注：磷校準(zhǔn)曲線：c=1.9372*A+0.0036 R2=0.9999 A：700 nm處樣品吸光度

結(jié)果表明：Rpx4菌株溶磷能力比較高，溶磷率達(dá)到5.23%；而對(duì)照菌株As1.0867溶磷率只有4.42%，菌肥1、2溶磷率分別為6.62%，2.35%。

3.2 溶磷菌菌種鑒定

分別以Rpx4和菌肥1,2溶磷菌的DNA為模板，用16S rDNA PCR引物做PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接送到成都擎科純化測(cè)序，利用NCBI中BLAST軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)搜索。結(jié)果表明：Rpx4與Bacillussp.(基因登錄號(hào)：KF482860.1) 的遺傳性最近，同源性為99%；菌肥1溶磷菌與Bacillussp.(基因登錄號(hào)：GQ169805.1)的遺傳性最近，同源性為99%；菌肥2溶磷菌與Bacillussp.(基因登錄號(hào)：KU986677.1)的遺傳性最近，同源性為99%；由此可見(jiàn)3種溶磷菌都是芽孢菌屬。

3.3 溶磷條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

圖1 不同pH值對(duì)3種溶磷菌解磷能力的影響注：圖1～5中，縱坐標(biāo)均表示發(fā)酵后發(fā)酵液中含磷量，單位為mg·L-1

從圖1可以看出隨著pH值的不斷升高，溶磷菌的溶磷能力不斷下降，其中菌肥1、菌肥2溶磷菌下降特別明顯，而Rpx4下降最慢，溶磷能力穩(wěn)定性最好，其適宜pH值范圍為5～9，最適pH值為6。從圖2可以看出，3種溶磷菌均在16 ℃～40 ℃時(shí)，溶磷能力穩(wěn)定變化不大，最適溫度出現(xiàn)在25 ℃～35 ℃之間。

圖2 不同溫度對(duì)3種溶磷菌解磷能力的影響

3.4 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

碳源：從圖3可以看出，Rpx4和菌肥2最佳碳源為草酸銨，菌肥1最佳碳源為甘露醇。對(duì)3種溶磷菌而言，草酸銨、蔗糖、甘油都是較好的碳源。氮源：從圖4可以看出，菌肥1和菌肥2最佳氮源為氯化銨，Rpx4最佳氮源為草酸銨。對(duì)3種溶磷菌而言，氯化銨、草酸銨都是較好的氮源。金屬離子：從圖5可以看出，F(xiàn)e3+、Mn2+對(duì)Rpx4溶磷有促進(jìn)作用，Mn2+、 Zn2+對(duì)菌肥1溶磷菌影響不顯著，F(xiàn)e3+、Ca2+對(duì)菌肥2溶磷菌有促進(jìn)作用，而Cu2+、Ni2+會(huì)抑制三種溶磷菌解磷。

圖3 不同碳源對(duì)3種溶磷菌解磷能力的影響

圖4 不同氮源對(duì)3種溶磷菌解磷能力的影響

圖5 不同金屬離子對(duì)3種溶磷菌解磷能力的影響

4 討論與結(jié)論

本研究從核桃林地土壤中分離得到一株高效溶磷菌Rpx4，通過(guò)16S rDNA鑒定為芽孢桿菌，目前芽孢桿菌的溶磷效果報(bào)道比較多，而且芽孢桿菌抗逆性強(qiáng)、能長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)，是比較好的一種菌肥菌種。有關(guān)細(xì)菌溶磷條件優(yōu)化多從碳源、氮源、pH值、溫度等方面進(jìn)行研究[7,8,9]，本研究通過(guò)搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)不同溫度、初始pH值、碳源、氮源和金屬離子對(duì)Rpx4的溶磷能力有很大影響。其適宜初始pH值范圍為5～9，適宜溫度范圍為16 ℃～40 ℃，適宜氮源有硫酸銨、氯化銨、草酸銨、蛋白胨，適宜碳源有草酸銨、蔗糖、甘油，高濃度Fe3+、Mn2+對(duì)其活力有一定的促進(jìn)作用，而Cu2+、Ni2+、Zn2+會(huì)抑制其解磷。通過(guò)比較不同發(fā)酵液配方及發(fā)酵條件下，Rpx4與兩種菌肥中的溶磷菌解磷能力得出，Rpx4明顯優(yōu)于肥料2溶磷菌，在溫度16 ℃～40 ℃、初始pH值為5～9時(shí)，其溶磷能力低于肥料1溶磷菌，但其溶磷能力穩(wěn)定性最好，且對(duì)蛋白胨、硝酸銨兩種氮源的適應(yīng)性也高于肥料1溶磷菌，該溶磷菌添加到菌肥中有一定的市場(chǎng)潛力。另外，有報(bào)道表明一些溶磷菌具有一定的促生效益，如提高種子的發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)，增加植物干重、株高及對(duì)磷的吸收的累積量等[10,11]。本研究只進(jìn)行了溶磷優(yōu)化條件試驗(yàn)，要真正應(yīng)用到微生物菌肥工業(yè)化生產(chǎn)中還需進(jìn)一步完善促生效益試驗(yàn)和生產(chǎn)工藝研究。