不同植物生長調(diào)節(jié)劑對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

薛曉曉，秦 棟，霍俊偉，劉慶帥，劉化禹，謝佳璇，孫小娟，員盎然

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，150030）

藍(lán)果忍冬（Lonicera caerulea L.）為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）的一種新興小漿果，俗稱藍(lán)靛果，我國大小興安嶺、長白山山區(qū)蘊含豐富的野生資源。其果實富含花色苷類、黃酮類以及多酚類等生物活性物質(zhì)，氨基酸，糖類，有機酸，礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，因此具有較高的營養(yǎng)和醫(yī)療保健價值，可以預(yù)防癌癥，心血管，神經(jīng)性，糖尿病等疾病[6]。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)

以2個引自俄羅斯的鮮食品種“邱雷姆”和“娜雷姆”為試材，MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)30d，取無菌苗中上部葉片，接種時在葉片正面橫切幾刀形成劃痕，葉片背面接觸培養(yǎng)基，接種到添加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH為5.8，附加不同生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基，于人工氣候室暗培養(yǎng)相應(yīng)時間后轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng)，培養(yǎng)40天后調(diào)查結(jié)果。暗培養(yǎng)條件為濕度75%，溫度25±1℃。

1.2 試驗處理及方法

1.2.1 單一植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)葉片愈傷組織

以兩品種的無菌苗葉片為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，選用6-BA、2，4-D、TDZ、ZT和CPPU五種激素設(shè)計成單因素試驗，濃度均為0.5、1.0、2.0mg/L。暗處理15天后置于光下培養(yǎng)。葉片在培養(yǎng)基培養(yǎng)40天后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.2 兩種植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)葉片愈傷組織

選用6-BA和2，4-D激素組合，TDZ和ZT激素組合，設(shè)計成兩個復(fù)因素試驗：暗處理15天后置于光下培養(yǎng)。葉片在培養(yǎng)基培養(yǎng)40天后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)情況。

6-BA設(shè)兩個水平：1.0、2.0mg/L，2，4-D設(shè)三個水平：0.2、0.5、1.0mg/L設(shè)計成6個水平組合的完全隨機試驗。

TDZ設(shè)兩個水平：1.0、2.0mg/L，ZT設(shè)三個水平：0.1、0.3、1.0mg/L設(shè)計成6個水平組合的完全隨機試驗。

1.2.3 三種植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)葉片愈傷組織

在MS培養(yǎng)基中添加6-BA（0.5、1.0、1.5mg/L），IBA（0.1、0.2、0.3mg/L）和KT（0.5、1.0、1.5mg/L），采用三因素三水平正交設(shè)計，按照L9（34）前三列安排試驗，共9個處理組合（表1）。暗處理35天，統(tǒng)計出愈率，褐化率，觀察愈傷組織狀態(tài)。

表1 藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)正交設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

出愈率（%）=愈傷組織數(shù)/外植體數(shù)×100，褐化率（%）=褐化葉片數(shù)/外植體數(shù)×100

所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖用SPSS19. 0 和 Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加兩種植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同生長調(diào)節(jié)劑組合對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果也不同。6-BA與2，4-D各個組合均能有效誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，但TDZ和ZT組合的誘導(dǎo)率極低，僅使邱雷姆出現(xiàn)少量愈傷且呈黃棕色，易褐化（見圖1-J）。

6-BA與2，4-D組合的各處理誘導(dǎo)率均可達100%，且愈傷組織多呈綠色、黃綠色、深綠色或淡黃色，表面有瘤狀突起，顆粒狀，質(zhì)地緊實，愈傷量多，愈傷組織生長快，無褐化（見圖1A-F）。這與單獨添加2，4-D誘導(dǎo)的愈傷組織有差異，可能是細(xì)胞分裂素與生長素相互作用的結(jié)果。各處理的愈傷量略有差異，當(dāng)6-BA濃度為1.0mg/L時，邱雷姆葉片愈傷量隨2，4-D濃度升高而增多，娜雷姆愈傷量則先增多后減少，在2，4-D濃度0.5mg/L時愈傷量達到最多，但少于邱雷姆。6-BA濃度為2.0mg/L時，兩品種都是在2，4-D濃度0.5mg/L時達到最大愈傷量。各處理的娜雷姆愈傷量普遍少于邱雷姆，這可能是由品種差異所致。

表2 6-BA 與2，4-D組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3 TDZ與ZT組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖1 兩種生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷組織

（A-F）6-BA+2，4-D誘導(dǎo)葉片愈傷組織；（A）愈傷啟動；（B）光下轉(zhuǎn)綠；（C-F）愈傷組織逐漸長大為深綠色致密型；（J、H）TDZ2.0mg/L+ZT1.0mg/L誘導(dǎo)的愈傷組織；（I）TDZ2.0mg/L+ZT0.3mg/L誘導(dǎo)的愈傷組織。

2.2 添加三種植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

三種調(diào)節(jié)劑6-BA、IBA、KT的9種組合處理對藍(lán)果忍冬不同品種葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果不同（表4），方差分析表明，影響邱雷姆葉片愈傷組織誘導(dǎo)的主次因素為IBA＞6-BA＞KT，而影響娜雷姆葉片愈傷組織誘導(dǎo)的主次因素為KT＞IBA＞6-BA（表5，6）；兩品種有所差異，這可能與不同品種對細(xì)胞分裂素的敏感性有關(guān)；MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+KT0.5mg/L（處理6）對兩品種的誘導(dǎo)率均達到95%以上，可以作為通用的體系。

三種調(diào)節(jié)劑組合各處理誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)基本相同，都為黃色顆粒狀，質(zhì)地較硬（圖2）。結(jié)合表4和圖2，不論是從誘導(dǎo)率還是愈傷量、褐化狀況考慮，邱雷姆的誘導(dǎo)效果均好于娜雷姆，這可能與品種差異有關(guān)。

2.3 三種不同添加方式對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)的比較

通過圖1、圖2愈傷組織形態(tài)對比以及表2、表4的數(shù)據(jù)對比，不同方案的愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。添加單一的生長調(diào)節(jié)劑，2，4-D是誘導(dǎo)藍(lán)果忍冬葉片產(chǎn)生愈傷組織最有效的物質(zhì)，濃度范圍0.5-2.0mg/L均有效，6-BA、TDZ、ZT、CPPU效果不好。

添加兩種調(diào)節(jié)劑處理好于單一調(diào)節(jié)劑處理，雖然2，4-D處理各濃度下出愈率都為100%，但愈傷組織質(zhì)地多為淡黃色或綠色水漬狀，較軟，而2，4-D和6-BA配合處理下愈傷組織顏色多為綠色顆粒狀，質(zhì)地緊實致密，有利于后期培養(yǎng)和不定芽誘導(dǎo)，且愈傷量也多于2，4-D單獨處理。

表4 6-BA、IBA、KT組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表5 娜雷姆葉片愈傷誘導(dǎo)率結(jié)果方差分析

表6 邱雷姆葉片愈傷誘導(dǎo)率結(jié)果方差分析

圖2 三種生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷組織

6-BA、IBA、KT三種調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)率低于2，4-D和6-BA配合處理，且愈傷啟動時間長，愈傷組織生長慢，該方案兩個品種的誘導(dǎo)效果差異很大，娜雷姆誘導(dǎo)率低，最低為處理4的59%（表4）。愈傷量很少且褐化率高（圖2-F），邱雷姆愈傷量很多（圖1A-C），與單獨添加2，4-D以及添加6-BA和2，4-D組合處理誘導(dǎo)的愈傷量相當(dāng)，但質(zhì)地更為緊實不易碎，相反6-BA和2，4-D組合處理則更加松脆（圖2）。

3 討論

藍(lán)果忍冬是極具開發(fā)前途的小漿果，但目前品種及優(yōu)良苗木缺乏。研究藍(lán)果忍冬的組織培養(yǎng)不但能提高苗木擴繁速度，更能加快品種選育進程，具有很大的實踐意義

在各種植物的愈傷組織誘導(dǎo)中，使用最多的是2，4-D。早熟禾種子單獨添加2，4-D即可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，1.0mg/L～2.0mg/L誘導(dǎo)效果較好，0.1或0.2mg/L 2，4-D與3mg/L 6-BA組合的誘導(dǎo)效果明顯好于2，4-D單獨處理，本試驗具有類似的結(jié)果，邱雷姆和娜雷姆分別在2，4-D濃度1.0和2.0mg/L時誘導(dǎo)效果最好，且6-BA與2，4-D組合處理好于2，4-D單獨處理。

一般高濃度2，4-D不利于愈傷組織誘導(dǎo)分化，黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋2，4-D2.0mg/L＋6-BA 0.5mg/L，愈傷組織分化培養(yǎng)基為 MS＋2，4-D1.0mg/L＋6-BA 0.5mg/L，即低濃度2，4-D利于分化，本研究娜雷姆在2，4-D濃度0.5mg/L時，愈傷組織更為致密，有利于愈傷組織的進一步分化。單獨使用6-BA不能誘導(dǎo)杜仲葉片產(chǎn)生愈傷組織，6-BA與生長素NAA配合使用可誘導(dǎo)出較好的愈傷組織，本研究結(jié)果也表明單獨添加6-BA的葉片愈傷組織誘導(dǎo)率為0，但與生長素2，4-D結(jié)合效果很好，表明細(xì)胞分裂素類和生長素類配合使用的愈傷組織誘導(dǎo)效果好于單獨使用生長素類。

單獨添加細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ、CPPU均能誘導(dǎo)毛桃葉片產(chǎn)生愈傷組織，1.0mg/L CPPU也能有效誘導(dǎo)苧麻葉片產(chǎn)生愈傷組織并再生不定芽。1.0mg/L ZT可誘導(dǎo)矮叢藍(lán)莓莖段直接器官再生，5.0mg/L ZT可誘導(dǎo)外植體通過愈傷組織途徑再生。本研究結(jié)果表明CPPU、TDZ、ZT雖然具有高活性，但對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不好，原因可能與物種不同有關(guān)。TDZ和ZT組合使蔓越橘莖段離體再生頻率能達到60%。本研究表明該組合效果不好，不適用于藍(lán)果忍冬的離體誘導(dǎo)及再生。

金鐵鎖上的研究表明在6-BA與生長素NAA組合的基礎(chǔ)上添加KT，帶芽莖段的出愈率和芽叢分化率均高達100%，本研究采用6-BA、2，4-D、KT組合處理時兩品種的誘導(dǎo)率均在60%以上，且邱雷姆在大部分處理下的誘導(dǎo)率為100%，證明KT對藍(lán)果忍冬愈傷組織誘導(dǎo)效果顯著，值得在今后的試驗中進一步研究。

利用葉片進行愈傷組織誘導(dǎo)具有取材廣，效率高的特點，可提高苗木快繁效率，是離體再生體系的建立的基礎(chǔ)；本試驗只是對不同生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織的誘導(dǎo)進行了初步研究，由愈傷組織到可在市場利用的完整植株還需經(jīng)過愈傷組織分化不定芽以及生根培養(yǎng)，煉苗移栽等多項環(huán)節(jié)，因此藍(lán)果忍冬的組培快繁體系的建立還需要進一步研究。