數(shù)字PCR技術(shù)及其應(yīng)用

楊茜

【摘要】數(shù)字PCR是繼第一代、第二代PCR技術(shù)之后，迅速發(fā)展起來(lái)的一種核酸絕對(duì)定量技術(shù)。在大量反應(yīng)室中獨(dú)立擴(kuò)增單分子核酸，采集產(chǎn)生的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算得到檢測(cè)結(jié)果。在病原微生物檢測(cè)、產(chǎn)前診斷以及癌基因診斷等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本文對(duì)數(shù)字PCR的原理、分類(lèi)以及應(yīng)用方面進(jìn)行了綜述。

【關(guān)鍵詞】數(shù)字PCR；醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)；分類(lèi)；應(yīng)用

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q503 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2018.06.17..02

1985年K.Mullis發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR），可以在體外模擬體內(nèi)核酸的合成過(guò)程，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期、降低科研成本，是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性壯舉。但傳統(tǒng)的PCR技術(shù)也有弊端，僅能進(jìn)行半定量測(cè)定，在分析產(chǎn)物時(shí)需要進(jìn)行開(kāi)蓋操作，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，能夠?qū)崟r(shí)定量檢測(cè)核酸的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（quantitative PCR，qPCR）、數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR，dPCR）也相繼出現(xiàn)，一舉攻克傳統(tǒng)PCR的技術(shù)難題。而數(shù)字PCR憑借其高通量、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，有著極為廣泛的應(yīng)用前景[2]。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR技術(shù)包括兩部分，PCR擴(kuò)增以及熒光信號(hào)分析。它的原理是將含有DNA模板的反應(yīng)體系稀釋分離成單分子，分配到大量的反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采集每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，有熒光信號(hào)記為1，無(wú)熒光信號(hào)記為0。通過(guò)陽(yáng)性微滴的比例或泊松分布公式計(jì)算樣本的原始濃度或拷貝數(shù)，最終獲得結(jié)果[3]。

2 數(shù)字PCR技術(shù)分類(lèi)

數(shù)字PCR的靈敏度取決于檢測(cè)器的靈敏度、PCR擴(kuò)增效率以及反應(yīng)單元的數(shù)目。根據(jù)反應(yīng)單元形成的不同方式，將PCR技術(shù)分為三類(lèi)系統(tǒng)：

2.1 微反應(yīng)室數(shù)字

PCR是在不銹鋼芯上刻蝕了數(shù)以千計(jì)的微反應(yīng)室，同時(shí)也將每個(gè)反應(yīng)單元的體積從微升級(jí)降至納升級(jí)，提高了樣品同量，但需要借助高通量的自動(dòng)點(diǎn)樣儀，提高了儀器成本和操作復(fù)雜性[4]。

2.2 微流控芯片數(shù)字

PCR是建立在微流體技術(shù)、納米制造技術(shù)和微電子技術(shù)等發(fā)展之上的，它的出現(xiàn)為我們提供了一個(gè)實(shí)現(xiàn)低成本、小體積和高通量PCR分析的理想平臺(tái)[5]。

2.3 液滴數(shù)字

PCR系統(tǒng)是在擴(kuò)增之前進(jìn)行微滴化處理，以極低的濃度包裹于油水兩項(xiàng)形成的數(shù)萬(wàn)個(gè)納升至皮升級(jí)液滴中，每個(gè)液滴都是一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)體系，擴(kuò)增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，破乳后收集進(jìn)行測(cè)序[6]。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于，能夠把不同模板的DNA分隔在不同的乳液中，避免了引物與引物之間、不同產(chǎn)物之間的相互影響[7]。同時(shí)可以在不同的反應(yīng)室中進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了高通量測(cè)定。

3 數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用

3.1 病原微生物的檢測(cè)

目前醫(yī)院主要通過(guò)qPCR對(duì)血液、腦脊液等臨床樣本進(jìn)行病原微生物的檢測(cè)，但qPCR仍存在較多缺點(diǎn)：不同實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品或者對(duì)照品之間存在誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或者不同實(shí)驗(yàn)室之間qPCR的檢測(cè)結(jié)果有差異，需建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)曲線[2] ；Yan[8]等采取感染H7N9的患者十個(gè)不同治療時(shí)期的樣本，分別進(jìn)行qPCR及dPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于qPCR陰性的樣本，dPCR仍可以檢測(cè)出病毒的存在，說(shuō)明dPCR的靈敏度遠(yuǎn)高于qPCR。數(shù)字PCR不僅可以對(duì)病原體定性，而且還能對(duì)病原體DNA或RNA序列進(jìn)行絕對(duì)定量，從而對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷、藥物療效觀察、病情判斷及預(yù)后觀察，目前數(shù)字PCR技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于HBV、HIV、甲型流感病毒等臨床領(lǐng)域[9]。

3.2 腫瘤診斷

許多腫瘤早期就出現(xiàn)癌基因的突變和表達(dá)異常，dPCR技術(shù)不僅能有效地檢測(cè)到癌基因的突變，而且可以準(zhǔn)確定量其表達(dá)。如肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體、神經(jīng)膠質(zhì)瘤異檸檬酸脫氫酶及葡萄膜黑色素瘤突變的檢測(cè)[9]。miRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，其與癌癥也密切相關(guān)[10]。田輝等人[11]建立了一種基于連接反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)單細(xì)胞中miRNA，這與研究與miRNA有關(guān)的疾病有著重要的意義。

3.3 產(chǎn)前診斷

產(chǎn)前診斷可以在出生前對(duì)胎兒的發(fā)育狀態(tài)、患有的疾病等方面進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)的侵入方法如羊水穿刺和絨毛取樣，存在讓孕婦流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[10]。1997年，LO[12]發(fā)現(xiàn)了存在于孕婦外周血的胎兒游離的cffDN A，為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新的思路。2017年，LO[13]利用數(shù)字PCR進(jìn)行了cffDNA的異常分析，用于21三體綜合征的診斷，上述方法可檢測(cè)血液中25%的胎兒基因。Barrett[14]利用cffDNA進(jìn)行了鐮狀紅細(xì)胞貧血的檢測(cè)。

dPCR作為一項(xiàng)新的技術(shù)，還存在許多問(wèn)題需要解決和探討。相信隨著科技的進(jìn)步與技術(shù)的革新，該技術(shù)定將廣泛的應(yīng)用在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙煥英，包金風(fēng).實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007（04）：492-497.

[2] 胡思宏，鮑登克，萬(wàn)紹貴.數(shù)字PCR及其在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2017，33（09）：861-866.

[3] 李春勇.數(shù)字PCR技術(shù)原理及應(yīng)用[J].生物技術(shù)世界，2014（11）：10-13.

[4] 林彩琴，姚 波.數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展，2012，24（12）：2415-2423.

[5] 王 琦，范 穎.微滴式數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志（電子版），2016，8（11）：15-19.

[6] 趙治國(guó)，崔 強(qiáng)，趙林立，王海艷，李剛，劉來(lái)俊，敖威華，馬彩霞.微滴數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2017，37（06）：93-96.

[7] 胡瑞麗，杜亞楠，趙 凱，施 偉，趙 笑，任方方，吳洋洋，唐雪明.微滴PCR技術(shù)的研究進(jìn)展[J].農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，2016，27（14）：290-291.

[8] Yan Y，Jia X J，Wang H H，et al.Dynamic quantification of avian influenza H7N9（A） virus in a human infection during clinical treatment using droplet digital PCR[J].Journal of Virological Methods，2016，234：22-27.

[9] 楊德平，劉維薇.數(shù)字PCR技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2016，34（10）：785-787.

[10] 馮兆民，舒躍龍.數(shù)字PCR技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào)，2017，33（01）：103-107.

[11] 田 輝.基于連接反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)單細(xì)胞中MicroRNA[D].陜西師范大學(xué)，2016.

[12] Lo，Dennis Y M，Corbetta，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet，1997，350（9076）：485-487.

[13] Lo Y M，Lun F M，Chan K C，et al.Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104（32）：13116-13121.

[14] Barrett，Angela N，McDonnell，Thomas C R，Chan，K C Allen，Chitty，Lyn S.Digital PCR Analysis of Maternal Plasma for Noninvasive Detection of Sickle Cell Anemia[J].Clinical Chemistry，2012，58（6）.

本文編輯：王雨辰