胞外聚合物對(duì)土壤中苯并芘的降解

甄 凱，單德鑫，歐瑞鵬，趙漢青，郭 玉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種普遍存在于環(huán)境中的持久性有機(jī)污染物，在環(huán)境中長(zhǎng)期積累會(huì)對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生巨大危害，是美國(guó)環(huán)境保護(hù)署公布的優(yōu)先控制污染物，即便在較低的濃度下也會(huì)對(duì)動(dòng)物、人類產(chǎn)生致癌、致畸、致不育作用[1-2]。因此，PAHs污染修復(fù)是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者共同研討的熱點(diǎn)課題，其中，生物修復(fù)技術(shù)因其處理效率高、降解徹底、不造成二次污染、操作簡(jiǎn)單、易行和費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，愈來(lái)愈受到學(xué)者們的關(guān)注。

胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）由微生物細(xì)胞分泌，是由多糖、蛋白質(zhì)和少量的脂類、核酸等構(gòu)成的有機(jī)高分子聚合物質(zhì)[3]。EPS對(duì)微生物細(xì)胞表面以及碳源（環(huán)境修復(fù)微生物中特指污染物）具有重大的影響，甚至是完全取決于胞外聚合物的作用[4]。EPS中包含大量的負(fù)電荷官能團(tuán)，對(duì)重金屬離子和有機(jī)污染物具有很強(qiáng)的結(jié)合能力[5-6]。研究結(jié)果表明，在PAHs的生物降解過(guò)程中，胞外聚合物可提高降解菌對(duì)PAHs的親和力[6]。

迄今為止，還未見(jiàn)有關(guān)EPS對(duì)土壤中PAHs降解特性的研究報(bào)道。因此，本研究選擇苯并芘（benzo[a]pyrene，以下簡(jiǎn)稱BaP）為研究對(duì)象，它是一種具有5個(gè)芳環(huán)結(jié)構(gòu)的多環(huán)芳烴[1]，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)苯環(huán)高度密集、辛醇-水分配系數(shù)高，因此，BaP在環(huán)境中殘留時(shí)間長(zhǎng)，較難被微生物降解[7]。

本研究考察EPS對(duì)土壤表面BaP降解的影響，旨在為探索污染土壤中PAHs的生物修復(fù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 假單胞菌是從中國(guó)黑龍江省大慶油田污染土壤中篩選、分離、馴化得來(lái)，命名為Pseudomonas sp.DNBe-S1（DNBe-S1）。從 DNBe-S1 的純液體培養(yǎng)物中提取EPS。

1.1.2 供試土壤 土壤樣品采自黑龍江省東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)無(wú)污染地域的表層（0～20 cm）土壤，為典型的北方黑土。將土壤樣品除去植物殘?bào)w及其他雜物，在室溫下自然風(fēng)干，磨碎并過(guò)2 mm篩，備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 采用了無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，用于DNBe-S1的培養(yǎng)，主要成分有硝酸銨1.0 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鈉1.5 g/L、氯化鈉1.0 g/L、七水硫酸鎂0.2 g/L，并添加BaP作為唯一碳源，蒸餾水1 L，pH值7.0～7.2；培養(yǎng)條件為：350℃，1 252 r/min，濕度為40%，培養(yǎng)36 h，取出待用。

1.2 方法

1.2.1 胞外多聚物（EPS）的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 DNBe-S1培養(yǎng)36 h后，取少量樣品，在4℃下以2 000×g離心10 min，除去上清液，用超純水沖洗沉淀物去鹽分，制成懸浮液。取少量懸浮液置于載玻片上制成標(biāo)本，在ZEISSAxioskop型光學(xué)顯微鏡下觀察，使用配置MC80顯微鏡用照相機(jī)拍攝。再取少量懸浮液置于蓋玻片上，待其自然風(fēng)干后直接噴金，然后在JSM-7001F型掃描電鏡下觀察EPS的微細(xì)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 胞外多聚物（EPS）的提取和組成測(cè)定 將培養(yǎng)的DNBe-S1在4℃下以4 300×g離心10 min，除去上清液，用超純水沖洗沉淀物3次，去除其中的鹽分?；厥粘恋砦锊腋∮诔兯校缓笤?℃下以20 000×g離心20 min以分離EPS。通過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾的上清液被認(rèn)為是DNBe-S1中的粗EPS。將粗EPS通過(guò)透析膜（3 500 Da）在4℃透析48 h進(jìn)行純化，每5 h更換一次超純水。所有低分子量有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)離子在該步驟中除去。純化的EPS樣品儲(chǔ)存在4℃直至使用[8]。

純化的EPS樣品糖類測(cè)定采用硫酸-苯酚法[9]，蛋白質(zhì)的測(cè)定采用Bradford法[10]。

1.2.3 苯并芘（BaP）在土壤中降解的模擬試驗(yàn) 將BaP溶解在甲醇中制備成BaP儲(chǔ)備液（0.03mol/L）。準(zhǔn)確稱取1 000 g風(fēng)干土壤樣品，用滴管吸取BaP儲(chǔ)備液加入土壤中，邊加邊混合，并在通風(fēng)櫥中操作。再用適量甲醇反復(fù)沖洗燒杯和轉(zhuǎn)移用滴管，確保BaP完全轉(zhuǎn)移至土壤中。待甲醇揮發(fā)完全后充分混合土樣，此時(shí)土壤樣品中BaP含量為100 mg/kg，置于通風(fēng)櫥中使其中的甲醇揮發(fā)后備用。為了檢驗(yàn)EPS對(duì)土壤中BaP降解特性的影響，處理土壤中分別混合5，10，15 mL的EPS懸浮液，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，混合日期視為第0天。并分別在第 0，7，14，21，28，35 天取樣，測(cè)定土壤中 BaP 的殘留量，每種處理有3個(gè)平行，在整個(gè)測(cè)試周期內(nèi)，添加無(wú)菌水以保持土壤中的含水量在30%。

1.2.4 土壤中苯并芘（BaP）的測(cè)定方法 土壤中BaP的提取和測(cè)定按照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外聚合物的組成與形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.1.1 胞外聚合物的組成 DNBe-S1中的EPS主要成分為蛋白質(zhì)，含量為68%，而多糖含量較低，僅為3.8%。

2.1.2 胞外聚合物的形態(tài)結(jié)構(gòu) Pseudomonas sp.DNBe-S1及其胞外聚合物的形態(tài)如圖1所示。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，圖1-A中細(xì)胞外亮光部分為EPS在細(xì)菌中的形態(tài)，而圖1-B為提取過(guò)后的形態(tài)。Pseudomonas sp.DNBe-S1為拉絲且含有孔狀結(jié)構(gòu)的聚合物。這樣的結(jié)構(gòu)為EPS吸附BaP并降解提供了良好的先決條件。

2.2 胞外聚合物對(duì)土壤中苯并芘的降解

從圖2可以看出，EPS確實(shí)可以促進(jìn)土壤中BaP的降解，未添加EPS的土壤中，第35天，只有20%的BaP被降解。在添加EPS的土壤中，前21 d，土壤中BaP迅速被降解，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，降解速度減慢；并且BaP的降解率隨著EPS添加體積的增加而提高，第35天BaP的降解率從42%（5 mL EPS）提高到 79%（15 mLEPS）。

3 討論

EPS中含有較多的負(fù)電荷官能團(tuán)，較少的正電荷官能團(tuán)[12]。當(dāng)微生物接近重金屬或其他污染物時(shí)，細(xì)胞壁外的EPS首先與它們進(jìn)行接觸。許多文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)靜電相互作用和配位反應(yīng)，EPS與金屬離子形成配合物[5，13]。因此，有理由推斷EPS在界面作用中可能發(fā)揮重要作用，同樣它在PAHs的生物降解中也可能發(fā)揮重要作用。EPS與PAHs的良好接觸有利于EPS與PAHs的相互作用。EPS對(duì)BaP的降解受到多種因素的影響，如土壤顆粒中BaP的解吸速度。EPS是含有親水部分和疏水部分的兩親化合物，因此，EPS能夠提高疏水物質(zhì)的溶解性[14]。PAN等[15]研究表明，EPS和菲之間的相互作用是自發(fā)的，它們的結(jié)合主要是由疏水相互作用決定的。LIU等[16]研究表明，細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物可以提高土壤中菲的解吸速度。因此，有理由推斷EPS也可以提高BaP在土壤表面的解吸速度。還需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定EPS與BaP之間具體存在哪種特定相互作用。此外，由于EPS在土壤中自然存在，因此，EPS在土壤修復(fù)應(yīng)用中將受到越來(lái)越多的關(guān)注。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從DNBe-S1中提取的EPS主要成分為蛋白質(zhì)，EPS可以促進(jìn)土壤中BaP的降解，并且BaP的降解率隨著EPS添加體積的增加而提高。這將促使人們更多地關(guān)注EPS在多環(huán)芳烴污染土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用。