輸合配穴針刺法促進(jìn)脂多糖LP S早產(chǎn)鼠腦損傷中MAG及NgR表達(dá)的研究*

李 楠，胡曉麗，王雪峰

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

人類新生兒尤其是早產(chǎn)兒存在高風(fēng)險(xiǎn)的腦損傷。腦性癱瘓定義了一組非進(jìn)行性機(jī)能損害綜合征，明顯存在于胎兒期或出生后早期生活階段。每千名新生兒中就有2.5名腦性癱瘓兒童［1］。然而腦性癱瘓?jiān)缜氨徽J(rèn)為主要是由于產(chǎn)時(shí)窒息缺氧引起的，實(shí)際上這個(gè)原因只占了引起兒童腦性癱瘓?jiān)虻囊恍〔糠?。最近的研究證明了胎兒或羊膜腔感染與腦性癱瘓有相關(guān)性，可以引起神經(jīng)發(fā)育障礙如神經(jīng)分裂癥［1］和帕金森氏?。?］。然而，引起腦性癱瘓大部分的病因仍然未知。近年來(lái)，流行病學(xué)研究顯示產(chǎn)婦感染包括泌尿系感染，牙周感染都有可能與子宮內(nèi)的炎癥、早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量、子癇前期和腦性癱瘓有關(guān)［3-4］。盡管細(xì)菌脂多糖(LPS)、活性氧、促炎細(xì)胞因子參與了發(fā)病機(jī)理，但產(chǎn)婦或胎兒感染危及胎兒發(fā)育的機(jī)制尚不清楚。LPS可以直接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)(如IL-6)和抗炎細(xì)胞因子(如IL-10)。LPS進(jìn)一步誘發(fā)介質(zhì)本身的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生［5］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供孕17天SD大鼠13只，平均體質(zhì)量320克，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)：SCXK(京)2007-0001。

1.1.2 脂多糖(LPS)溶液的配制 將1 mg LPS由Sigma公司提供(Lipopol-ysaccharides，Escherichia coli 055：B5溶于10mL生理鹽水中。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 將10只脂多糖組孕鼠從孕17天開(kāi)始到出生，每12小時(shí)注射200 μg/kg脂多糖，3只生理鹽水組孕鼠給予腹腔注射同劑量的生理鹽水［6］。設(shè)定孕22天前分娩的仔鼠為早產(chǎn)鼠。本實(shí)驗(yàn)將LPS足月產(chǎn)乳鼠剔除，新生早產(chǎn)鼠隨機(jī)分配為針刺組和非干預(yù)組。觀察者采用盲法的方式隨機(jī)分配每只孕鼠接受脂多糖或生理鹽水注射以減少偏差。

1.2.2 動(dòng)物分組 本實(shí)驗(yàn)中5只孕鼠腹腔注射脂多糖后于孕22天前分娩仔鼠56只，其中6只死亡，剩余50只仔鼠隨機(jī)分為針刺組(n=30)和非干預(yù)組(n=20)。此外，3只孕鼠腹腔注射生理鹽水后，于孕22天分娩仔鼠30只，無(wú)死亡，從中隨機(jī)選出20只做為對(duì)照組。到生后21天為止，針刺組和非干預(yù)組均死亡5只，對(duì)照組無(wú)死亡。

1.2.3 干預(yù)方法 選取出生后3日齡針刺組仔鼠給予針刺治療，按照“輸合配穴”理論選取“曲池”“三間”“足三里”“陷谷”進(jìn)行手針治療，日一次不留針，干預(yù)至仔鼠3周齡。非干預(yù)組及對(duì)照組正常喂養(yǎng)不予干預(yù)措施，全部乳鼠每日進(jìn)行一次神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 新生鼠發(fā)育測(cè)試結(jié)果 按照Wu等［7］人提出的新生鼠13項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)試，分別為平面翻正、覓食反射、懸崖回避、負(fù)趨地性、前肢放置、前肢抓握、耳朵抽搐、驚愕反射、空中翻正、活動(dòng)力、睜眼時(shí)間、懸吊試驗(yàn)、曠野試驗(yàn)。全部新生乳鼠從出生后第1天至第21天，每天從第1項(xiàng)至第11項(xiàng)進(jìn)行一次測(cè)試，出生后第21天對(duì)第12項(xiàng)和第13項(xiàng)進(jìn)行測(cè)試以避免出現(xiàn)選擇偏倚。觀察者采用盲法，兩人為一組對(duì)乳鼠進(jìn)行評(píng)估。反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為30秒內(nèi)，無(wú)反應(yīng)計(jì)分為30秒。

1.3.2 病理觀察 乳鼠出生后，取胎盤做HE染色，以觀察孕鼠宮內(nèi)感染情況，以大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)做為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 MAG及NgR表達(dá)的測(cè)定 針刺組和非干預(yù)組2組分別于仔鼠出生后7天，14天及21天各隨機(jī)選5只斷頭取腦用于制作石蠟切片，應(yīng)用western blot方法觀察MAG及NgR的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料采用(±s)表示，采用方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行比較。P＜0.05表示有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生鼠發(fā)育測(cè)驗(yàn)結(jié)果 平面翻正、懸崖回避及驚愕反射針刺組、非干預(yù)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。前肢放置測(cè)試針刺組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，非干預(yù)組與與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。懸崖回避測(cè)試針刺組與非干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。懸吊實(shí)驗(yàn)、曠野實(shí)驗(yàn)3組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。負(fù)趨地性測(cè)試和耳朵抽搐測(cè)試這2項(xiàng)未測(cè)出結(jié)果。見(jiàn)表1。

表1 新生乳鼠神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)試結(jié)果 分

2.2 蛋白免疫印跡結(jié)果

2.2.1 MAG的表達(dá) 脂多糖新生乳鼠生后7天即可見(jiàn)MAG的表達(dá)，生后14天逐漸升高，生后21天逐漸下降但仍高于生理鹽水組。針刺組和對(duì)照組生后7天相對(duì)光密度值分別為(0.251±0.006)和(0.149±0.006)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；生后 14 天分別為(0.267±0.017)和(0.155±0.014)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；生后21天分別為（0.310±0.007)和(0.166±0.005)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖1—2。

圖1 乳鼠腦組織MAG免疫印跡分析，1-3分別為對(duì)照組生 7d、14d、21d；4-6 分別為針刺組生后 7d、14d、21d

圖2 MAG不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)光密度值， 各組比較有顯著性差異（P＜0.01）

2.2.2 NgR的表達(dá) 隨發(fā)育成熟NgR的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。生后7天即可見(jiàn)NgR的表達(dá)，生后14天至生后21天NgR的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。針刺組及對(duì)照組生后7天相對(duì)光密度值分別為 (0.234±0.006)和(0.114±0.004)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；生后 14 天分別為(0.289±0.006)和(0.131±0.003)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；生后21天分別為(0.335±0.007)和(0.186±0.004)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖3—4。

圖3 乳鼠腦組織NgR免疫印跡分析，1-3分別為對(duì)照組 生后 7d、14d、21d；4-6 分別為針刺組生后 7d、14d、21d

圖4 NgR不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)光密度值， 各組比較有顯著性差異（P＜0.01）

3 討論

腦白質(zhì)損傷的特征是喪失前髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞，是早產(chǎn)兒腦損傷最常見(jiàn)的形式，并伴有神經(jīng)發(fā)育障礙的高風(fēng)險(xiǎn)［8］。其中最嚴(yán)重的損害發(fā)生在不成熟的大腦，可以導(dǎo)致類似于腦性癱瘓的終身運(yùn)動(dòng)、姿勢(shì)及認(rèn)知的失調(diào)［9-10］。WMI的病理生理學(xué)是很復(fù)雜的，產(chǎn)婦感染是其發(fā)育過(guò)程中的重要因素［11-12］。

《靈樞·邪氣藏府病形》曰：“滎輸治外經(jīng)，合治內(nèi)府?！本褪钦f(shuō)輸穴多治療經(jīng)脈的外周病證，肢節(jié)竣痛及五臟病變。五輸穴之井、滎、輸、經(jīng)、合與人體皮、脈、肉、筋、骨、臟腑的對(duì)應(yīng)關(guān)系也具有相似對(duì)應(yīng)的主治規(guī)律。合穴位于肘膝關(guān)節(jié)附近，是經(jīng)氣由此深入進(jìn)而會(huì)合于臟腑的部位，歷來(lái)醫(yī)家多認(rèn)為其具有較強(qiáng)的健脾強(qiáng)胃，扶正培元，提高臟腑功能的作用，則多治臟腑的內(nèi)在疾患。通過(guò)上述分析，本實(shí)驗(yàn)中選用的輸合配穴法，至陰經(jīng)即為原合配穴法，陰經(jīng)之五輸穴中合穴為井穴之母，根據(jù)針灸中“補(bǔ)母瀉子法”，進(jìn)針時(shí)兩穴均采用補(bǔ)法，可直接調(diào)節(jié)五臟之原氣，激發(fā)患兒原動(dòng)力；至陽(yáng)經(jīng)進(jìn)針時(shí)采用瀉輸補(bǔ)合之手法，以舒筋通脈，調(diào)節(jié)筋肉不利之癥。從而起到和內(nèi)調(diào)外，標(biāo)本兼治的作用。

髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)表達(dá)于CNS的少突膠質(zhì)細(xì)胞和PNS的雪旺細(xì)胞，是髓鞘的重要組成成分。隨著后來(lái)研究的深入發(fā)現(xiàn)MAG具有雙重作用，即一方面可以抑制發(fā)育中的小腦、成熟胚胎背根神經(jīng)節(jié)(DRG)及NG108-15細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)，另一方面能夠促進(jìn)新生DRG軸突的生長(zhǎng)，主要取決于神經(jīng)元的年齡。國(guó)外有研究報(bào)道NgR基因可以影響小鼠的行為。

此實(shí)驗(yàn)首次采用國(guó)外對(duì)于腦癱乳鼠機(jī)能和認(rèn)知發(fā)育評(píng)估使用的神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)試項(xiàng)目，對(duì)新生乳鼠從出生后第1天至第21天每天進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)。通過(guò)對(duì)孕鼠腹腔注射脂多糖后可以引起乳鼠腦白質(zhì)損傷，但是并不能出現(xiàn)與中度至重度腦癱患兒一致的腦性癱瘓表型。此外，通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)鑒定后發(fā)現(xiàn)，使用“輸合配穴”針刺法治療還是有效的。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的是，研究通過(guò)慢性刺激的炎癥反應(yīng)引起未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷增加。但是由于研究的時(shí)間過(guò)短，并沒(méi)有觀察到LPS處理組老鼠表現(xiàn)出腦性癱瘓的表型特點(diǎn)。今后進(jìn)一步的研究將重新設(shè)定LPS使用時(shí)間和劑量，以及神經(jīng)行為學(xué)觀測(cè)時(shí)間，以觀察LPS處理組老鼠從幼年期到成年期的變化。