血漿SEPT9基因甲基化監(jiān)測結(jié)直腸癌術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的應用價值

張姍 房春芳 丁潔 付波 陳雙峰 焉鵬

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年升高。手術是目前治療結(jié)直腸癌的主要手段，但是30%～50%結(jié)直腸癌患者在根治術后出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移，這成為結(jié)直腸癌患者的主要死亡原因。血清CEA水平是臨床用于患者術后監(jiān)測的生物學標志物，但因敏感度和特異性低而限制其在結(jié)直腸癌早期診斷及復發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測中的應用［1］。DNA甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件，近期國內(nèi)外研究表明血漿SEPT9基因甲基化（mSEPT9）檢測在結(jié)直腸癌患者中均有較高的敏感度和特異性［2?8］，有望成為臨床診斷結(jié)直腸癌最有價值的分子標志物。但其在結(jié)直腸癌術后隨訪監(jiān)測中的應用前景尚未明確。本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者根治術后血清CEA水平和血漿mSEPT9狀態(tài)，探討血漿mSEPT9作為監(jiān)測結(jié)直腸癌術后復發(fā)轉(zhuǎn)移標志物的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2013年2月至2015年1月聊城市人民醫(yī)院經(jīng)病理組織學確診、行根治性手術治療的214例Ⅰ～Ⅲ期原發(fā)性結(jié)直腸癌患者臨床資料，其中男性118例，平均年齡（63.24±11.35）歲；女性96例，平均年齡（63.77±9.35）歲。病理學分期采用美國癌癥聯(lián)合會/國際抗癌聯(lián)盟（AJCC/UICC）結(jié)直腸癌TNM分級系統(tǒng)（2009年第7版）。所有患者術前無遠處轉(zhuǎn)移病灶。本研究經(jīng)聊城市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準（批號：2016031），患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及血清（漿）樣本制備 留取結(jié)直腸癌患者術前及根治術后空腹外周血，其中2 mL置促凝管內(nèi)，2 000 r/min離心10 min分離血清，用于檢測血清CEA水平；10 mL置Vacutainer?K2EDTA抗凝真空采血管（英國BD?Plymouth公司）內(nèi)，離心自然停止，（2 500±500）r/min離心12 min。取出采血管，將血漿轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，再次離心，將離心后的血漿3.5 mL轉(zhuǎn)移至新的離心管中。血漿樣本保存于?80℃冰箱用于mSEPT9檢測。

1.2.2 游離核酸提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化 利用Epipro Colon Plasma Quick Kit試劑盒（德國Epigenomics AG公司）采用磁珠法提取血漿游離DNA，經(jīng)裂解、洗滌、洗脫等步驟獲得約100μL游離DNA。洗脫液加入150μL亞硫酸鹽溶液和25μL保護液80℃恒溫孵育45 min。加入磁珠結(jié)合后，3次洗滌磁珠，室溫干燥后加入60μL洗脫液，23℃下洗脫亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA。

1.2.3 實時熒光探針PCR檢測mSEPT9狀態(tài) 采用Epi proColon 2.0試劑盒（德國Epigenomics AG公司）在ABI7500 PCR儀（美國Applied Biosystems公司）上進行血漿mSEPT9 V2區(qū)檢測，反應體系為15μL PCR預反應液加入15μL經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA樣本，進行3重平行PCR測試。PCR擴增條件：94℃預變性20 min；93℃變性30 s，62℃退火5 s，55.5℃延伸35 s，45個循環(huán)。結(jié)果判讀：依據(jù)試劑盒說明書，測試樣本內(nèi)參基因β?actin的Ct值≤32.1結(jié)果為判定有效，試劑盒提供的陽性和陰性對照作為質(zhì)控品。3重平行測試中，2重及以上mSEPT9的Ct值＜45結(jié)果判定為陽性，反之為陰性。

1.2.4 血清CEA水平檢測 應用電化學發(fā)光法，采用CEA檢測試劑盒（德國Roche公司）在Elecsys 2010分析儀（德國Roche公司）上進行CEA濃度測定。依據(jù)試劑盒說明書，CEA濃度≥5 ng/mL為陽性。

1.2.5 隨訪 患者術后隨訪3年，第1年每3個月隨訪檢查1次，后2年每6個月1次，定期復查結(jié)腸鏡、胸腹部CT、檢測血清CEA水平和血漿mSEPT9狀態(tài)等。如術后3年內(nèi)死亡即結(jié)束隨訪。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)變量以x±s表示，率的比較采用χ2或Fisher精確檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者術前臨床病理特征與血漿mSEPT9和血清CEA的關系

214例患者術前150例血漿mSEPT9檢測陽性，陽性率為70.1%（150/214），陽性率隨TNM分期而增高，Ⅰ期為46.2%（24/52）、Ⅱ期為66.7%（76/114）、Ⅲ期為83.8%（62/74），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.027），血漿mSEPT9與患者年齡和性別之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術前血清CEA濃度與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別及TNM分期之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 結(jié)直腸癌患者術前臨床病理特征與血漿mSEPT9和血清CEA的關系

2.2 結(jié)直腸癌患者手術前后血漿mSEPT9及血清CEA變化

結(jié)直腸癌根治術后，18例患者血漿mSEPT9檢測為陽性，陽性率為8.4%，與術前（陽性率70.1%）相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖1A）。術后CEA濃度為（1.44±1.68）ng/mL，與術前（5.34±10.19）ng/mL相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖1B）。術后mSEPT9陽性率與臨床病理分期之間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.566，圖1C）。

2.3 結(jié)直腸癌患者術后復發(fā)、轉(zhuǎn)移患者血漿mSEPT9陽性率與血清CEA陽性率的比較

214例患者術后隨訪3年中，結(jié)直腸癌復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移患者64例，其中肝轉(zhuǎn)移22例、局部復發(fā)9例、肺轉(zhuǎn)移11例、骨轉(zhuǎn)移7例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例、多器官轉(zhuǎn)移12例?；仡櫺苑治?4例復發(fā)轉(zhuǎn)移患者的術前與術后血漿mSEPT9陽性率發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計學意義（81.3%vs.21.9%，P＜0.001，圖1D）。在64例患者隨訪過程中，血漿mSEPT9檢測陽性為50例，陽性率為78.1%，血清CEA檢測陽性26例，陽性率為40.6%，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。術后隨訪發(fā)現(xiàn)5例mSEPT9持續(xù)陽性患者中4例1年內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移。圖2所示為典型病例監(jiān)測結(jié)果。

圖1 血漿mSEPT9在結(jié)直腸癌根治術療效評價中的應用價值

2.4 血漿mSEPT9聯(lián)合血清CEA檢測對結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的診斷效力

在64例結(jié)直腸癌復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移患者中，血漿mSEPT9聯(lián)合血清CEA檢測陽性為54例，陽性率為84.4%。兩者聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線見圖3。mSEPT9聯(lián)合CEA檢測ROC曲線下面積（AUC）值為0.960，兩者聯(lián)合檢測診斷復發(fā)轉(zhuǎn)移的敏感度和特異性分別為84.4%和94.4%。

圖2 血漿mSEPT9和血清CEA監(jiān)測結(jié)直腸癌復發(fā)典型病例結(jié)果

圖3 血漿mSEPT9與血清CEA聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移ROC曲線

3 討論

目前研究證實結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與基因突變及表觀遺傳學改變有關［9?10］，結(jié)直腸癌患者腫瘤組織、血液和糞便中均可檢測到相關基因的甲基化改變［11］。SEPT9 基因位于17q25.3，編碼 SEPT9蛋白，SEPT9蛋白屬于GTP結(jié)合蛋白，其生物學功能主要是參與細胞質(zhì)分裂和細胞骨架結(jié)構(gòu)形成［12］。SEPT9基因改變最終導致細胞基因組不穩(wěn)定，易向腫瘤轉(zhuǎn)變。SEPT9基因通過選擇性剪接可產(chǎn)生18種不同的轉(zhuǎn)錄本，共可編碼15種不同的多肽段。mSEPT9在結(jié)直腸癌中高甲基化，在其他腫瘤及正常細胞中甲基化程度低［13］。在血漿中，mSEPT9被認為是結(jié)直腸癌特異性的腫瘤標志物，同時也是一種無創(chuàng)、簡便、易行的篩查和早期診斷指標［2］。Warren 等［14］報道m(xù)SEPT9在結(jié)直腸癌中的陽性率達90%。Lee等［15］報道m(xù)SEPT9在結(jié)直腸癌中的陽性率為36.6%。研究報道，mSEPT9基因用于檢測結(jié)直腸癌的陽性率分別為71.05%和80.0%［4，7］。本研究共納入214例患者，利用Epipro Colon 2.0試劑盒檢測mSEPT9，手術治療前mSEPT9陽性率為70.1%，陽性率與TNM分期相關，與性別和年齡不相關。上述研究結(jié)果提示血漿mSEPT9是高效特異的非侵入性診斷結(jié)直腸癌的分子標志物。

血漿mSEPT9在結(jié)直腸癌根治術評價及復發(fā)監(jiān)測中的價值尚缺乏報道。本研究發(fā)現(xiàn)術后血漿mSEPT9陽性率為8.4%，與術前（陽性率70.1%）相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），提示血漿mSEPT9可以用于結(jié)直腸癌手術療效評價。在復發(fā)監(jiān)測中，本研究結(jié)果顯示術后隨訪監(jiān)測復發(fā)轉(zhuǎn)移血漿mSEPT9陽性率為78.1%，提示血漿mSEPT9可以作為結(jié)直腸癌患者術后監(jiān)測預后的分子標志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，術后血漿mSEPT9持續(xù)陽性的患者多數(shù)在1年內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移，雖然樣本例數(shù)較少，但也進一步提示mSEPT9陽性可能與患者的不良預后相關，這與文獻報道相一致［16］。

血清CEA是結(jié)直腸癌診斷中常用腫瘤學標志物，被廣泛用于已行手術根治的結(jié)直腸癌患者的隨訪監(jiān)測。本研究結(jié)果顯示，手術后血清CEA濃度顯著降低，與手術前CEA濃度相比差異具有統(tǒng)計學意義［（1.44±1.68）ng/mLvs.（5.34±10.19）ng/mL，P＜0.001）］，進一步證實血清CEA可用于結(jié)直腸癌手術療效評價。另外，手術前后或化療過程中血清CEA水平的變化常被用來判斷治療效果［17］。Tong等［18］研究認為術后血清CEA水平升高是結(jié)直腸癌患者復發(fā)轉(zhuǎn)移的風險因素，在復發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中，血清CEA檢測陽性率為40.6%，說明血清CEA可以用于結(jié)直腸癌復發(fā)監(jiān)測。但血漿mSEPT9在結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移患者中檢測陽性率為78.1%，與血清CEA相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），提示血漿mSEPT9在結(jié)直腸癌復發(fā)監(jiān)測中優(yōu)于血清CEA檢測。同時，本研究表明血漿mSEPT9聯(lián)合血清CEA檢測可以提高監(jiān)測結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的檢出率，提示聯(lián)合檢測可以作為結(jié)直腸癌術后復發(fā)轉(zhuǎn)移更靈敏的監(jiān)測方法。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血漿mSEPT9不僅適用于結(jié)直腸癌輔助診斷，而且在結(jié)直腸癌手術療效評價及復發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測中均具有良好的靈敏度。但本研究中血漿mSEPT9所采用檢測方法僅為定性的PCR技術，研發(fā)靈敏度高的定量檢測方法可能更有利于結(jié)直腸癌患者術后復發(fā)監(jiān)測。同時，多中心、大樣本量的臨床研究將對該技術的臨床推廣更有意義。