鳳丹灰霉病病原鑒定與發(fā)病條件研究

羅長維，陳 友

(1.重慶城市管理職業(yè)學院，重慶 401331； 2.中國林業(yè)科學研究院 資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224)

鳳丹(PaeoniaostiiT.Hong & J.X.Zhang)隸屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)，落葉小灌木，為楊山牡丹變種，因產(chǎn)于安徽銅陵的鳳凰山和南陵西山得名[1]。鳳丹花冠潔白碩大，單花頂生，肉質(zhì)根皮肥厚，經(jīng)干燥可制成中藥丹皮。芍藥屬植物主要分布于中國，大部分種類雄蕊瓣化嚴重，結(jié)籽少或不結(jié)實；少數(shù)種類為單瓣花冠，結(jié)實量較大，如鳳丹。鳳丹蓇葖果具5～7枚單果，每果黑色種子數(shù)可達50粒。種仁富含具“血液營養(yǎng)素”美稱的α-亞麻酸，含量高達42%，遠高于其他食用油，為我國近年來重點發(fā)展的優(yōu)質(zhì)食用油原料[2-3]。由于結(jié)果率高、種子量大、生態(tài)適應(yīng)性廣等優(yōu)點，且兼具觀賞、藥用價值，鳳丹在我國山東、河南等黃河流域及重慶、湖南等長江流域均有廣泛種植[1-2]。盡管鳳丹籽油品質(zhì)優(yōu)良、種植面積大，由于存在病害嚴重以及缺乏籽油良種等問題，種子產(chǎn)量無法滿足鳳丹籽油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的需求。

灰霉病是世界上最具毀滅性的植物病害之一，由半知菌亞門的葡萄孢真菌(Botrytisspp.)與類葡萄孢真菌(Botrytis-like fungi)引起。國外對灰霉病研究比較深入，在病原菌生物生態(tài)學特性、致病機制、抗病性誘導(dǎo)以及綜合防治等方面均取得了較大進展[4]。我國對灰霉病的研究則相對滯后，以化學防治的藥效研究為主，也有關(guān)于其病原菌生物學特性、抗藥性等方面的報道[4-7]?；颐共∫彩俏覈P丹生長期的主要病害，嚴重影響其結(jié)果率與種子產(chǎn)量。目前，有關(guān)鳳丹的研究主要集中于良種選育、籽油化學組成和加工等方面，尚無有關(guān)鳳丹灰霉病的報道[3]。對芍藥屬其他植物灰霉病的報道表明，牡丹灰霉病在我國的山東、河南等地，以及牡丹分布的歐洲西部與美洲均普遍發(fā)生[5-11]，主要由灰葡萄孢(B.cinereaPers，有性型BotryotiniafuckelianaWhetzel)、牡丹葡萄孢(B.paeoniaeOudem.)或假灰葡萄孢(B.pseudocinere)侵染引起[8-11]。其中，灰葡萄孢為一種泛化性的兼性寄生真菌，出現(xiàn)在200多種植物上[4]。該病原菌主要靠分生孢子隨氣流、雨水以及農(nóng)具等傳播擴散[7]，防治較為困難。牡丹葡萄孢目前僅在芍藥屬植物上發(fā)現(xiàn)，危害程度相對較輕[11]。假灰葡萄孢常常與葡萄孢真菌伴生，在葡萄、牡丹等多種寄主植物的灰霉病病原菌中均有發(fā)現(xiàn)，危害通常較小[10-11]。基于此，本研究對鳳丹灰霉病病原進行鑒定，并對其田間發(fā)病規(guī)律與流行特點進行分析，以期了解該病的發(fā)生危害條件，為下一步病害的有效防控提供實踐依據(jù)和理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗點位于重慶市墊江縣長龍鎮(zhèn)(107.406 42°E、30.305 57°N)。墊江縣地處華鎣山脈東部，地貌以丘陵為主，海拔320 ～1 183 m，年均溫16 ℃，年均日照 1 260 h，年均降水量1 160 mm，為中亞熱帶季風性濕潤氣候。墊江為我國中藥材丹皮的主產(chǎn)區(qū)之一，也是重慶鳳丹主要種植地，灰霉病危害較重。試驗點鳳丹居群株齡約為5 a，株高1.0～1.2 m，株行距(0.6～0.8)m×(0.8～1.0)m。

1.2 研究方法

1.2.1 病原菌鑒定 于2017年4月采集鳳丹灰霉病感病器官(花果、莖葉)30份，分株分類裝入紙袋，在實驗室內(nèi)通過組織分離法對病原菌進行分離與純化。將供試菌株移植于PDA培養(yǎng)基平板上，置于20 ℃恒溫箱培養(yǎng)，在顯微鏡下對病原菌的培養(yǎng)性狀及分生孢子梗、分生孢子、菌核等形態(tài)特征進行觀察。

1.2.2 病原菌越冬分析 于2016年7月采集鳳丹感病部位(花、果、莖、葉)，干燥后置于硫酸紙袋內(nèi)，分別存放于室內(nèi)、置于室外干燥通風處、置于室外地表(紗網(wǎng)袋內(nèi))以及埋于土壤里(深度10 cm)，于次年3月取出樣本進行病菌分離培養(yǎng)，并在顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 流行規(guī)律及發(fā)病條件分析 于2015—2018年的3—6月選擇有代表性地塊約1 hm2作系統(tǒng)監(jiān)測田，定點、定株、定期調(diào)查灰霉病田間流行動態(tài)與發(fā)病條件。采用平行線取樣法取5個樣點進行調(diào)查，每點選標準株20株，調(diào)查花果發(fā)病情況，重復(fù)3次。前期調(diào)查表明，鳳丹灰霉病基本上僅危害花果，極少危害莖干、葉片，因此灰霉病發(fā)病情況的調(diào)查依據(jù)為花果是否感病。其中，病情按花朵或果實病斑面積占整個花朵或果實面積比例來分級：0級—無病斑，1級—病斑面積5%以下，3級—病斑面積6%～10%，5級—病斑面積11%～20%，7級—病斑面積21%～50%，9級—病斑面積50%以上[12]。發(fā)病率與病情指數(shù)計算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果用平均值±標準誤表示。采用SPSS 22.0軟件對鳳丹灰霉病的發(fā)病率與病情指數(shù)進行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳丹灰霉病的病原鑒定與危害特征

經(jīng)形態(tài)鑒定，鳳丹灰霉病的病原為灰葡萄孢(B.cinereaPers)，屬半知菌亞門(Deuteromyeotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomycetales)、淡色孢科(Moniliaceae)、葡萄孢屬(Botrytis)。其菌絲體表生，分生孢子梗直立，數(shù)根叢生，分生孢子多為橢圓形或卵形，少數(shù)球形，在分枝末端聚生成葡萄穗狀，淡褐色至無色，單胞?；移咸焰呔鸀榧嫘约纳婢芤跃z、分生孢子及菌核的形式感染，以壞死組織為寄主，能殺死植物細胞，并在植物的壞死組織上生長發(fā)育。灰葡萄孢菌群在形態(tài)上有所差異，可能來自于不同的菌群亞型。病菌危害部位初期產(chǎn)生透明的點狀病斑，之后擴大呈不規(guī)則形，長出灰色菌絲。病部菌絲發(fā)展到一定階段時，可產(chǎn)生大量分生孢子梗，其上聚生葡萄穗狀分生孢子，使病部呈灰霉狀，病斑處有時產(chǎn)生黑色顆粒狀的菌核。

鳳丹灰霉病主要危害幼嫩花果，包括花蕾(圖1A)、花朵(圖1B)、幼果(圖1C)及中果(圖1D)，極少感染嫩葉與莖干。一般從花萼開始感病，病斑逐漸從花萼端部擴展至花萼基部，隨后侵染花瓣基部與花梗，花瓣與花蕊隨之感病。由于許多花朵生長略有傾斜，雨水易積部位常常先受害。由于田間濕度大，感病花瓣無法干燥并脫落完全。殘留花瓣黏附在子房基部，成為幼果灰霉病侵染源?；颐共“l(fā)病迅速，花果一旦感病，感病部位(花瓣、花藥以及掉落在花瓣上的花粉、幼果)很快變褐、軟腐。

A.感病花蕾；B.感病花朵；C.感病幼果；D.感病中果圖1 鳳丹灰霉病感病癥狀

2.2 鳳丹灰霉病的發(fā)生規(guī)律

2.2.1 病原菌的越冬 病原菌越冬檢測結(jié)果表明，在室內(nèi)存放和懸掛于室外的花果病殘體中均未分離到灰葡萄孢；位于地表的花果病殘體與埋于土表層下10 cm的花果病殘體中也始終未能分離到該病原菌。病殘體上僅分離到1種專性腐生真菌鏈格孢菌[Alternariaalternata(Fr.) Keissler]，可能為灰霉病感染后期侵入的病原菌。上述觀測結(jié)果表明，灰葡萄孢在鳳丹果實上發(fā)病完成生活史后，無法在感病花果上繼續(xù)生存，后期可能主要以菌核殘留在土壤中越夏、越冬。

2.2.2 田間流行動態(tài) 鳳丹灰霉病從3月上旬開始發(fā)生。3月中旬至下旬，隨著氣溫的上升，花朵發(fā)病率呈上升趨勢，但差異并不顯著?；ǘ浒l(fā)病率在3月上旬與4月上旬之間差異顯著。從4月上旬開始，日均溫上升到19 ℃，發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長，4月上旬、4月下旬與5月上旬之間發(fā)病率呈現(xiàn)顯著差異。5月上旬后，發(fā)病率不再上升，5月上旬、5月中旬、5月下旬與6月上旬之間發(fā)病率均無顯著差異(圖2)。

病情指數(shù)與發(fā)病率在5月上旬前存在正相關(guān)。鳳丹灰霉病致病性強，花果一旦被感染，快速引發(fā)宿主軟腐，引起成熟或衰老組織的嚴重破壞，導(dǎo)致其腐爛，因此鳳丹發(fā)病率與病情指數(shù)在前期密切相關(guān)。從3月上旬到4月上旬，病情指數(shù)隨時間呈緩慢上升趨勢，但無顯著差異。病情指數(shù)在3月上旬與4月中旬之間差異顯著。隨著4月氣溫升高，病原菌增殖周期縮短，病情指數(shù)上升速度較快，4月中旬與5月上旬之間病情指數(shù)具有顯著差異。5月上旬后，病情指數(shù)呈下降趨勢，且5月上旬、5月中旬、5月下旬與6月上旬之間的病情指數(shù)無顯著差異(圖2)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同圖2 鳳丹灰霉病發(fā)生動態(tài)

2.3 環(huán)境因子對鳳丹灰霉病發(fā)病的影響

2.3.1 年份 從圖3可以看出，鳳丹灰霉病年年發(fā)生，但發(fā)病率與病情指數(shù)在不同年份存在顯著差異。

圖3 年份對鳳丹灰霉病發(fā)病的影響

其中，2016年鳳丹感病最重，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為61.10%、50.22。在2015年，鳳丹發(fā)病率與病情指數(shù)分別為53.33%、42.35，發(fā)病情況與2016年相比差異不顯著，但病情稍輕。2017年鳳丹發(fā)病較輕，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為35.00%、22.19。2018年鳳丹發(fā)病最輕，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為17.00%、9.20。

2.3.2 花朵開放時期 從圖4可以看出，不同時期開放的花朵，其發(fā)病率與病情指數(shù)有顯著差異。3月20日(早期)開放的花朵，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為25.00%、12.19，感病最輕，大部分花朵能發(fā)育為成熟蓇葖果；3月25日(中期)開放的花朵，花朵發(fā)病率與病情指數(shù)分別為36.33%、22.35，發(fā)病情況與早期相比明顯加重；4月1日(晚期)開放的花朵，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為58.10%、49.22，發(fā)病最重。

圖4 花朵開放時期對鳳丹灰霉病發(fā)病的影響

2.3.3 大田地勢 鳳丹灰霉病的發(fā)生也受大田地勢影響。丘間谷地地勢最低，發(fā)病最重，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為56.67%、50.92，其次為丘陵坡地，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為27.50%、24.55，隨后為丘陵階地，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為22.17%、18.34，丘陵頂部最低，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為9.17%、4.11。總體上不同地勢之間差異顯著(圖5)。

圖5 大田地勢對鳳丹灰霉病發(fā)病的影響

2.3.4 土質(zhì)類型 鳳丹灰霉病的發(fā)生還受土壤質(zhì)地的影響。鳳丹在黏土中受害最重，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為60.5%、49.65，壤土中受害其次，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為31.83%、19.69，在排水良好的石礫土(石谷子地)中受害最輕，發(fā)病率與病情指數(shù)分別為19.17%、12.12。3種土質(zhì)類型之間差異顯著(圖6)。

圖6 土質(zhì)類型對鳳丹灰霉病發(fā)病的影響

3 結(jié)論與討論

通過4 a定點試驗研究，結(jié)果表明：(1)鳳丹灰霉病病原菌為半知菌亞門的灰葡萄孢；(2)鳳丹灰霉病為低溫高濕型病害，發(fā)生規(guī)律與氣候因子密切相關(guān)；(3)不同年份、花期、大田地勢與土質(zhì)類型對灰霉病發(fā)病都有一定的影響。

鳳丹灰霉病病原菌為半知菌亞門的灰葡萄孢。對于芍藥屬植物灰霉病的病原菌，各地報道不一。歐美等地報道牡丹灰霉病病原主要有灰葡萄孢、牡丹葡萄孢和假灰葡萄孢3種[11,13]，其中灰葡萄孢危害最重，牡丹葡萄孢危害其次，假灰葡萄孢危害最輕[11]。我國對芍藥屬植物灰霉病病原的研究結(jié)果差異較大。楊瑞先等[7]與陳士寧等[14]分別報道河南洛陽的牡丹與北京的芍藥灰霉病病原菌為灰葡萄孢。薛杰等[5]和易圖永等[15]分別報道山東與湖南兩地牡丹灰霉病的病原菌為牡丹葡萄孢。楊瑞先等[6]隨后通過RAPD方法對牡丹灰霉病病原菌進行分子生物學鑒定，證實其為灰葡萄孢，且菌群類型多樣。本研究對重慶墊江鳳丹灰霉病感染的花果與莖葉進行采集，采集時間位于灰霉病發(fā)病中期，均只發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢，未發(fā)現(xiàn)牡丹葡萄孢，這與楊瑞先等[6-7]、陳士寧等[14]的鑒定結(jié)果一致，與薛杰等[5]、易圖永等[15]的鑒定結(jié)果不同，與歐美等地病原菌差異較大。因此，鳳丹灰霉病的病原是否有牡丹葡萄孢，還有待進一步觀測研究。

鳳丹灰霉病為低溫高濕型病害，發(fā)生規(guī)律與氣候因子密切相關(guān)。灰葡萄孢菌的生長適溫是16～24 ℃，超過20 ℃產(chǎn)孢能力顯著降低，超過24 ℃則菌株生長緩慢[14]。許多學者對草莓、番茄等作物的灰霉病發(fā)生規(guī)律進行研究，結(jié)果表明，灰霉病一般在陰雨潮濕的天氣容易出現(xiàn)發(fā)病高峰[16-17]。重慶大部分地區(qū)初春低溫多雨低光照，鳳丹生長勢弱，細胞膨壓低，抗病性差，而病菌仍能萌發(fā)侵染，因此低溫多雨低光照的初春有利于分生孢子的大量形成和傳播，植株易受病菌感染。5月上旬后，氣溫升高、空氣濕度降低、光照增加，對灰霉病菌的萌發(fā)與生長及產(chǎn)孢量均具有抑制作用，發(fā)病率雖未下降，但病情指數(shù)逐漸降低。此外，濕度的晝夜變化對灰霉病發(fā)生也有影響，早晨由于溫度的逐漸升高與濕度的下降使分生孢子釋放于周圍空氣中，導(dǎo)致分生孢子擴散，而夜間的高濕則有利于灰葡萄孢的萌發(fā)與生長[14]。

不同年份、不同花期對灰霉病發(fā)病都有一定的影響。年份不同，降雨量與溫度存在差異，植株發(fā)病率也隨之變化[18]。在2015年、2016年、2017年與2018年的2—4月，墊江縣的降雨量分別為230.2 mm、260.8 mm、173.0 mm與190.6 mm。灰葡萄孢菌分生孢子隨降水、空氣等傳播，盡管2018年降雨量與2017年差異不大，但降雨基本發(fā)生在夜間，白天常為晴天，因此發(fā)病最輕。而2016年降雨量最多，因此灰霉病流行，發(fā)病也最重。降雨量大、光照不足時也會引起田間濕度大，植株生長弱，利于病原菌的萌發(fā)與生長[18]。尤其不利的是，感病花瓣在田間濕度較大時不易脫落，常常殘留在幼果基部，在增加幼果基部空氣濕度的同時，也明顯增加了病菌數(shù)量，從而增加幼果感病率。相反，如果田間濕度低，花瓣易干燥脫落，花果感病則較輕。此外，鳳丹花朵開放時間越晚，感病則越重。一方面，開花較晚的花朵通常受限于營養(yǎng)供給，生長發(fā)育緩慢、抗病能力較弱；另一方面，由于清明節(jié)的到來，降水量逐漸增加及田間濕度提高，適于灰霉病病原菌的增殖與傳播，因此灰霉病發(fā)生更為嚴重。

大田地勢與土質(zhì)對灰霉病的影響也較大。位于丘陵頂部的地塊地下水位低，鳳丹長勢好，且丘陵頂部風大、田間濕度低，因此發(fā)病最輕。反之，丘間谷地地下水位高、土壤透氣性差，鳳丹長勢差，而且丘間風小、田間濕度大，鳳丹發(fā)病最重。生長勢的差異決定著鳳丹抗病性的高低。生長勢良好的鳳丹抗病性強，一方面通過增強機械阻擋來完成，如增強細胞膨壓，相應(yīng)的抗病原菌侵染能力強，另一方面則是通過增強與抗病相關(guān)的生物酶活性來提高抗病性，因而長勢好的鳳丹不易受害或受害輕，且受害后更容易恢復(fù)。以往很多研究也表明，灰霉病、灰斑病等多種植物病害皆易發(fā)生于洼地或谷地等地勢低矮之處[16,18]。在3種土壤質(zhì)地中，黏土種植的鳳丹發(fā)病最重，石礫土種植的鳳丹發(fā)病最輕。種植在石礫土里的鳳丹根系正常，而種植在黏土里的鳳丹其根頸處的表皮普遍存在軟腐。這表明由于黏土含空氣較少，鳳丹根系呼吸作用受到抑制，并進一步影響其養(yǎng)分吸收與植株生長勢。可能與鳳丹根系為肉質(zhì)根，耐干旱而不耐水濕，喜干燥疏松、排水良好的土壤有關(guān)。

致謝: 感謝洛陽理工學院楊瑞先副教授與西南大學周彤副教授在鳳丹灰霉病病原菌鑒定中給予的支持與幫助。