Th17通過(guò)NF-κB和P38調(diào)控急性腦梗死大鼠炎性損傷的實(shí)驗(yàn)研究

田嘉瑩， 盛寶英， 韓 鳳， 姜堯佳， 李叢言， 畢 勝

急性腦梗死是目前致殘率、病死率最高的疾病之一，因其易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特點(diǎn)引起了人們的重視[1]。急性腦梗死后可引起缺血中心區(qū)和周?chē)鷧^(qū)神經(jīng)元損傷，其致病機(jī)制之一是全身炎癥反應(yīng)綜合征。然而需要特殊強(qiáng)調(diào)的是腦內(nèi)的強(qiáng)炎性反應(yīng)引起腦組織病灶區(qū)的損傷比缺血本身更嚴(yán)重[2]。因此，恢復(fù)及保持腦梗死后機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的正常對(duì)腦梗死患者具有重要的臨床意義。

輔助性T細(xì)胞17( T helper 17 cells,Th17)是最近新發(fā)現(xiàn)的一群獨(dú)特的CD4+輔助性T細(xì)胞亞群。相關(guān)研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病中Th17細(xì)胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，急性腦梗死患者缺血部位Th17浸潤(rùn)、活化后可有效透過(guò)血-腦脊液屏障、高表達(dá)顆粒酶 B、導(dǎo)致神經(jīng)元損傷并分泌多種細(xì)胞因子，參與自身免疫應(yīng)答[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察Th17及其效應(yīng)分子的動(dòng)態(tài)變化，確定其在急性腦梗死發(fā)生發(fā)展中的免疫調(diào)節(jié)作用。以期為急性腦梗死后炎癥反應(yīng)的有效控制降低腦損傷程度提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 BCA蛋白定量試劑盒(BOSTER，Prod：AR0146)，兔源β-Actin 單克隆抗體(Cell signaling，13E5)，兔源NF-κB P-65多克隆體抗(Affinity，AF5006)，兔源p-P38 單克隆抗體(Cell signaling，D3F9)。

1.2 急性腦梗死大鼠模型構(gòu)建 按照常規(guī)方法-線栓法[4]通過(guò)手術(shù)制備大腦中動(dòng)脈閉塞 (middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為300 mg/kg。頸部正中縱行切開(kāi)，暴露左側(cè)頸總和頸外動(dòng)脈，分離迷走神經(jīng)以防損傷。阻斷頸總動(dòng)脈的近心端下微血管血流后，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和近心端之間插入普通尼龍線栓，使一側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞。120 min后拔出線栓，縫合、消毒。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈，隨即縫合切口。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8～10周齡的雄性SD大鼠，體重250～300 g，共20只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組，MCAO 24 h、72 h和假手術(shù)組，5只/組。

1.4 模型評(píng)價(jià) 模型制備后24 h，動(dòng)物應(yīng)清醒。隨即采用Bederon[4]等的方法通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分確定模型是否構(gòu)建成功。 計(jì)分方法如下：(1)提大鼠尾巴，觀察右前肢內(nèi)收、內(nèi)旋情況，根據(jù)輕重程度，評(píng)分為1～3分。4分：大鼠身體右側(cè)旋轉(zhuǎn)。(2)大鼠肌張力評(píng)定：借助金屬網(wǎng)，通過(guò)向后輕拉大鼠尾巴觀察雙側(cè)前肢肌張力，根據(jù)輕重程度，評(píng)分為0～2分。(3)借助光滑平面，觀察側(cè)向推擋阻力。0分：兩側(cè)推無(wú)顯著差別;1分：右側(cè)明顯弱于左側(cè);2分：向右推大鼠向右側(cè)傾倒。(4)大鼠左上眼瞼下垂且分泌物增多，評(píng)為2分。總分10分。以上評(píng)分相加為最后得分，大于3分屬于造模成功，低于3分直接剔除。

1.5 外周血Th17細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè) 制備流式細(xì)胞儀樣品，三色標(biāo)記Th17細(xì)胞：抗CD3-FITC單克隆抗體、抗CD4-PE單克隆抗體和抗IL-17A-APC單克隆抗體，另設(shè)陰性對(duì)照管。流式細(xì)胞儀專用染色管中加入EDTA抗凝血0.1 ml，紅細(xì)胞裂解液裂解3次，3%FCS洗滌3次后加入CD3-FITC單克隆抗體、抗CD4-PE單克隆抗體抗體孵育30 min進(jìn)行表面染色，3%FCS洗滌后加入固定透膜劑孵育，隨后加入抗IL-17A-APC熒光抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國(guó)B&D公司)檢測(cè)，應(yīng)用FACSCELLQUEST軟件，每個(gè)樣品分析10000個(gè)細(xì)胞，以陰性對(duì)照為參考，將對(duì)照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點(diǎn)陣圖顯示，記錄Th17細(xì)胞的百分率。

1.6 Western blotting檢測(cè)大鼠腦組織中NF-κB P65和p-P38表達(dá)水平 動(dòng)物脫臼處死，取出大腦，冰凍的PBS清洗組織表面血液，取梗死部位大腦組織，置于玻璃勻漿器內(nèi)，加蛋白裂解液均漿后BCA法測(cè)蛋白濃度，上清液-80 ℃保存。適量蛋白上樣后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)后5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加NF-κB p65 (1∶1000)、p- P38(1∶1000) 和β-actin抗體，4 ℃ 孵育過(guò)夜，室溫下HRP標(biāo)記的二抗(1∶10000)孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。采用 Image-J圖像分析軟件，計(jì)算各指標(biāo)相對(duì)于內(nèi)參的相對(duì)吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量變化 與假手術(shù)組(Sham)相比，急性腦梗死大鼠出血24 h(MCAO 24 h)和72 h(MCAO 72 h)組外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量均明顯增加(P<0.01)；與MCAO 24 h組相比，MCAO 72 h組外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

2.2 大鼠腦組織中NF-κB P65蛋白表達(dá)變化 與Sham組相比，MCAO 24 h和72 h組腦組織中NF-κB P65蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；但是腦梗死后的時(shí)間并沒(méi)有明顯影響腦組織中NF-κB P65蛋白的表達(dá)(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

2.3 大鼠腦組織中p-P38蛋白表達(dá)變化 與Sham組相比，MCAO 24 h和72 h組腦組織中p-P38蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.0,1)；但是腦梗死后的時(shí)間并沒(méi)有明顯影響腦組織中p-P38蛋白的表達(dá)(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

與Sham組比較**P<0.01; 與MCAO 24 h組比較#P< 0.05

圖1 急性腦梗死大鼠外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量變化

與Sham組比較**P< 0.01

圖2 急性腦梗死大鼠腦組織中NF-κB P65蛋白表達(dá)變化

與Sham組比較*P< 0.05，**P< 0.01

圖3 急性腦梗死大鼠腦組織中p-P38蛋白表達(dá)變化

3 討 論

感染并發(fā)癥在腦梗死患者中的發(fā)生率約為21%～65%[5,6]，是腦組織損傷的主要誘因，與腦梗死患者的臨床結(jié)局和長(zhǎng)期預(yù)后密切相關(guān)[7]。然而，關(guān)于腦梗死后機(jī)體如何發(fā)揮抗感染免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，迄今為止仍然存在大量未知領(lǐng)域。相關(guān)研究表明，CD4+T細(xì)胞亞群之間的相互作用是免疫調(diào)節(jié)平衡作用的關(guān)鍵因素之一。CD4+T細(xì)胞的免疫失調(diào)在急性腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。然而，Th17作為致炎性細(xì)胞因子IL-17的主要來(lái)源，是否參與了急性腦梗死后炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的繼發(fā)性腦水腫和腦損害，目前尚無(wú)定論。

相關(guān)研究證明，Th17可能參與了頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生/發(fā)展，腦梗死患者外周血的Th17比例及IL-17水平越高，頸動(dòng)脈斑塊越大[8]。然而動(dòng)脈粥樣硬化是急性腦梗死發(fā)生的主要原因。Shichita等研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死發(fā)生后出血周?chē)哪X組織中大量T細(xì)胞浸潤(rùn)，并且腦組織的損傷及神經(jīng)功能的缺失與IL-17和IL-23水平升高密切相關(guān)[9]。由此可見(jiàn)，Th17不僅參與了急性腦梗死的發(fā)生，而且在急性腦梗死后繼發(fā)性腦水腫和腦損傷的病理過(guò)程中也占有重要一席。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，急性腦梗死大鼠外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并與出血時(shí)間呈正相關(guān)(見(jiàn)圖1)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，腦出血后血腫周?chē)M織在發(fā)病24～72 h炎癥反應(yīng)及組織損傷最為嚴(yán)重。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，Th17在外周血中的增加與腦組織炎癥反應(yīng)及損傷時(shí)間上一致，進(jìn)一步證實(shí)急性腦梗死后Th17參與了腦組織的炎癥反應(yīng)。Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮重要作用。IL-17作為T(mén)h17的特征性/效應(yīng)性細(xì)胞因子，與受體結(jié)合后通過(guò)活化MAPK(絲裂原而活化蛋白激酶)和NF-κB(核因子κB)激活多種免疫細(xì)胞(包括樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)，尤其是中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)多種促炎性因子調(diào)控固有和特異性免疫應(yīng)答引起組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并導(dǎo)致組織破壞[10]。為了明確Th17是如何參與急性腦梗死大鼠腦部免疫細(xì)胞的活化和誘導(dǎo)，在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了p-P38和NF-κB P65蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與Th17在外周血中的百分比完全一致。由此證明Th17細(xì)胞可通過(guò)調(diào)控NF-κB和P38的活化調(diào)控急性腦梗死大鼠腦部炎癥反應(yīng)。

卒中后的免疫炎性反應(yīng)對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)是一把雙刃劍。根據(jù)卒中后缺血發(fā)生的時(shí)間長(zhǎng)短、免疫細(xì)胞的種類(lèi)和數(shù)量或者小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度等來(lái)評(píng)定免疫細(xì)胞是發(fā)揮損傷性作用還是保護(hù)性作用[11]。因此我們發(fā)現(xiàn)，如果腦梗死發(fā)生后的免疫炎性反應(yīng)能夠進(jìn)行人為調(diào)控，誘導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)適度從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性作用，達(dá)到操控腦梗死的臨床過(guò)程和預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死后發(fā)生的炎性反應(yīng)與Th17細(xì)胞密切相關(guān)，因此臨床上可以通過(guò)調(diào)控IL-17的水平改善卒中后的炎性反應(yīng)，為其后發(fā)生的腦水腫和腦損傷提供新的治療途徑。