急性腦梗死的血漿代謝標志物研究

李 深， 徐桂蓮， 張興哲， 孫正武， 儲成艷， 耿 欣， 高 鵬， 藍曉艷

腦梗死是世界范圍內(nèi)成人致死和致殘的主要原因[1,2]。其中，缺血性腦梗死是由于腦動脈的狹窄或閉塞造成腦組織的缺血壞死，占所有腦梗死的70%以上[3]。快速可靠的腦梗死診斷對于優(yōu)化臨床治療、改善患者預后具有積極作用。目前CT和MRI等影像學方法已被廣泛用于腦梗死的診斷，但其有操作復雜、需搬動患者、花費大等弊端，尋找對腦梗死診斷和病情演變具有指示作用的血液生物學標記物具有重要意義。

代謝組學高通量地研究體液或組織的全部代謝產(chǎn)物，可用于分析疾病的發(fā)病機制，也可用于篩選疾病的生物標志物[4]。目前已有多個針對腦梗死患者的代謝組學研究[5～9]，但這些研究均只比較了腦梗死患者和健康對照者的代謝組學差異，沒有設(shè)置其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組，降低了其結(jié)果的特異性。本研究通過多元統(tǒng)計分析比較腦梗死患者、其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者和健康對照者血漿代謝物的差異，并利用受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線檢驗了篩選得到的潛在生物標志物對腦梗死的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 十三烷酸、甲醇、甲氧胺吡啶、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)購自美國Sigma公司。美國Labconco公司真空冷凍干燥機；美國BD公司EDTA真空抗凝管；德國Eppendorf公司低溫高速離心機；美國Agilent Technologies公司GC-MS代謝組學分析儀。

1.2 臨床患者入組 連續(xù)收集自2017年1月1日-2017年5月31日于大連市中心醫(yī)院住院治療的急性腦梗死患者(S組，n=33)、其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者(DC組，n=40)和來院體檢的健康對照者(HC組，n=35)血漿。腦梗死的納入標準為：(1)急性神經(jīng)功能缺損癥狀出現(xiàn)小于7 d；(2)核磁共振彌散加權(quán)成像確定為新發(fā)腦梗死；(3)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分≥4分。為增加代謝組學篩選的特異性。本研究還納入了一組除急性腦血管病外其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組(包括8例帕金森氏病、6例阿爾茲海默病、5例急性面神經(jīng)炎、5例癲癇、4例多發(fā)性硬化、3例顱內(nèi)腫瘤、3例急性脊髓炎、3例格林巴利綜合征、2例運動神經(jīng)元病、1例梅杰綜合征)。兩組的排除標準均為：(1)存在出血、感染、創(chuàng)傷、昏迷或任何其他并發(fā)癥；(2)腎、肝功能不全、心力衰竭、呼吸衰竭或任何其他器官功能不全；(3)懷孕或月經(jīng)期；(4)近期接受手術(shù)治療(2 w內(nèi))；(5)急性心肌梗死(3月內(nèi))。研究方案經(jīng)大連市中心醫(yī)院倫理委員會審查和批準(編號2017-010-20)，所有參與實驗的對象均簽署書面知情同意書。

1.3 樣品準備 清晨空腹采血，離心5 min(3000 rpm,4 ℃)，收集上清于冰上將50 μl血漿加入至200 μl含20 μg/ml十三烷酸(內(nèi)標)的冰冷甲醇中，離心10 min沉淀蛋白(12,000 g,4 ℃)。收集上清，通過Labconco真空冷凍干燥機真空干燥和濃縮上清。以甲氧胺吡啶溶液(50 μl,20 mg/ml)再次溶解干燥的上清物，40 ℃水浴90 min。隨后，加入40 μl的N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺進行三甲硅烷基化作用60 min至代謝組學分析。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)代謝組學分析 參照報道的方法進行GC-MS代謝組學分析[10]。采用Agilent7890/5975C GC-MS儀采集血漿樣品的代謝組譜。將1 μl處理的樣品以10∶1分流比例注入至Da B-5融合石英的毛細管柱(30×0.25 mm×0.25 μm)。熱循環(huán)程序設(shè)置如下：初始氣相色譜箱溫度設(shè)為70 ℃，維持3 min，然后以5 ℃/min的速度升至300 ℃，維持5 min。樣品注入溫度為300 ℃，輸送管道溫度為280 ℃。高純度氦(99.9996%)用作運載氣體，恒定流速為1.2 ml/min。質(zhì)譜以2光譜/秒的掃描速度獲得，質(zhì)量掃描范圍設(shè)定為m/z 33-600。

2 結(jié) 果

2.1 組間一般資料 臨床信息和血液生化檢驗的比較 入組急性腦梗死患者的一般資料(見表1)。對3組間的性別、年齡、吸煙及飲酒史、體重指數(shù)、糖尿病、高血壓、血脂、血同型半胱氨酸和尿酸水平進行比較發(fā)現(xiàn)糖尿病和高血壓患病率在S組較在DC組高。糖化血紅蛋白和血糖在S組較DC組及HC組高。血肌酐、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇在S組和DC組間無顯著差異。

2.2 急性腦梗死患者的代謝組改變 代謝組學篩選顯示了各組間VIP>1的共137種代謝物，包括含氮化合物、脂肪酸及其衍生物以及單糖類及其衍生物等。其中，有37種代謝物在任意兩組間有顯著統(tǒng)計學差異(見表2)。在S和HC組之間、S與DC組之間以及DC與HC組之間分別有26種、16種和23種顯著變化的代謝物。有12種代謝物在S組與DC組之間以及S組與HC組之間呈同向性顯著性差異：葡萄糖、阿拉伯呋喃糖、丁酸、甘露糖、古洛糖、異丙基1β-D-硫代半乳糖苷、呋喃半乳糖苷、棕櫚酸(在S組顯著增高);2-哌啶甲酸、焦谷氨酸和1,5-無水-D-山梨醇(在S組顯著下降)。這些代謝物參與糖代謝、氨基酸代謝或脂肪酸代謝。

2.3 異常調(diào)節(jié)的代謝物作為腦梗死診斷的可行性評價 在上述顯著變化的12種代謝物中，有8種與糖代謝有關(guān)，因腦梗死組較對照組的糖尿病患者多，他們可能對腦梗死不具有特異性。因而，我們僅進一步分析了2-哌啶甲酸、焦谷氨酸、丁酸和棕櫚酸這4種代謝物對于腦梗死的診斷價值。ROC曲線分析顯示它們用于診斷急性腦梗死的最佳界點值分別為：丁酸：0.931(敏感度81.8%，特異度80%)；2-哌啶甲酸：1.497(敏感度90.9%，特異度54.3%)；焦谷氨酸：1.391(敏感度93.9%，特異度45.7%)；棕櫚酸：1.452(敏感度66.7%，特異度88.6%)。曲線下面積分別為：丁酸：0.826(95%可信區(qū)間為：0.726～0.926，P<0.05)；2-哌啶甲酸：0.737(95%可信區(qū)間為：0.619～0.855，P<0.05)；焦谷氨酸：0.729(95%可信區(qū)間為：0.610～0.848，P<0.05)；棕櫚酸：0.727(95%可信區(qū)間為：0.594～0.860，P<0.05)。此外，為了排除糖尿病及血糖水平對這4種代謝物的影響，我們對樣本中16例無糖尿病的腦梗死患者與健康對照組之間進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示丁酸、2-哌啶甲酸、焦谷氨酸和棕櫚酸在兩組間均有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 代謝組學篩選個體的基本信息

S組與DC組相比**P<0.01；S組與HC組相比##P<0.01

表2 代謝組學篩選得到的各組間差異表達的代謝物

S組與DC組相比*P<0.05，**P<0.01；S組與HC組相比#P<0.05，##P<0.01；DC組與HC組相比△P<0.05，△△P<0.01,“-”代表兩組間無差異

3 討 論

傳統(tǒng)的疾病研究一直是針對特定的基因、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物[11]，并不足以理解復雜疾病的全貌，因為其他的、無靶向的和潛在未知的生物分子可能參與病理機制[5]。近年來，“組學”技術(shù)因其對生物分子的綜合分析受到了廣泛關(guān)注。代謝組學，作為基因組信息的復合表型之一，可能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學未能揭示的生物學現(xiàn)象[12]。現(xiàn)有的代謝組學研究顯示乳酸、丙酮酸、乙醇酸、甲酸酯、F2-異前列腺素在腦梗死后增加，而谷氨酰胺和甲醇的含量下降[5,7,8]。然而，我們的研究結(jié)果表明乳酸和丙酮酸等在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者血漿中的變化與腦梗死患者相同，因而對腦梗死并沒有特異性。尋找高靈敏性和特異度的腦梗死生物標志物有可能為早期、快速、可靠診斷和準確評估病情提供有力幫助。

我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)焦谷氨酸、丁酸和2-哌啶甲酸對于腦梗死的診斷均具有較高的敏感度(分別為93.9%、81.8%和90.9%)，而棕櫚酸具有較高的特異性(88.6%)。丁酸和棕櫚酸是脂肪酸家族成員，其在腦梗死患者中含量的增加提示脂肪酸代謝的紊亂[13]。2-哌啶甲酸是賴氨酸代謝的產(chǎn)物[14]，參與纖維蛋白溶解過程。焦谷氨酸是谷胱甘肽生物合成中的重要分子[6,15]，腦梗死患者中焦谷氨酸的降低提示患者體內(nèi)氧化應激造成的還原性物質(zhì)減少。然而，焦谷氨酸和2-哌啶甲酸診斷缺血性腦梗死的特異性較低(分別為45.7%和54.3%)，可能與腦梗死過程中氧化應激以及賴氨酸代謝的廣泛性、復雜性有關(guān)。

綜上，我們對急性腦梗死患者的血漿代謝組進行了研究，創(chuàng)新性地加入了非腦梗死的神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組，提高了腦梗死生物標志物篩選的特異性，其臨床意義一旦確定，有助于開發(fā)更簡易、便捷的診斷檢測方法。然而，我們的結(jié)果仍有待更大規(guī)模、多中心的臨床研究驗證。此外，還需要進一步探索聯(lián)合生物標記模式在早期識別腦梗死患者中的作用。