新型AMPA受體拮抗劑對腦梗死再灌注損傷的保護(hù)作用

許 位, 石秋艷， 孫 原， 李冬梅， 李 弘， 王翠蘭

缺血性腦卒中涉及多種病理生理過程[1～3]，其中興奮性氨基酸大量釋放是加重腦損傷的一個非常重要的環(huán)節(jié)，當(dāng)腦動脈供血中斷、能量代謝障礙，引起突觸前神經(jīng)末梢大量釋放興奮性氨基酸，同時由于興奮性氨基酸的滅活、再攝取障礙及其受體的過度激活，使神經(jīng)元興奮性持續(xù)增高，引起神經(jīng)元的損傷[4～6]。非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈[7～10]，因其水溶性好，更易透過血腦屏障(blood-brain barrier)，能阻止Ca2+、Na+內(nèi)流增加，從而增加細(xì)胞膜電位穩(wěn)定性，阻礙興奮性氨基酸谷氨酸大量釋放而引起的AMPA受體過度激活，使神經(jīng)元興奮性降低，目前他侖帕奈處于3期臨床試驗(yàn)階段，主要用于抗癲癇治療，它是否對缺血性腦卒中有治療作用，國內(nèi)目前還無相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同組的大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能損傷評分、海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)變化，同時測定TAL亞組腦梗死周圍區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞及梗死皮質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元存活數(shù)量，探討他侖帕奈對大鼠急性腦梗死缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 60只SD雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量約250～300 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究動物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號：SCXK-(軍)2011-003]，在實(shí)驗(yàn)室于安靜環(huán)境中進(jìn)行2～4 w適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲水，正常飲食。術(shù)前3 h禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組：假手術(shù)組(10只，Sham組)、模型組 (10只，MCAO組)、實(shí)驗(yàn)組(40只，TAL組)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組給藥時間的不同將TAL組再分為TAL 0 h組、TAL 1 h組、TAL 3 h組、TAL 5 h組，每組10只大鼠。

1.2 制備動物模型 大鼠于術(shù)前禁食3 h，將水合氯醛(3.5 mg/kg)于大鼠內(nèi)腹腔注射進(jìn)行麻醉。采用改良Longa線栓法[11]制作大鼠急性缺血再灌注損傷模型，采用尼龍線栓(型號：2634-A4，北京西濃科技有限公司，中國)阻塞大鼠右側(cè)大腦中動脈，制備MCAO(middle cerebral artery occlusion)模型。在阻斷缺血2 h后，取出尼龍線栓，恢復(fù)血供。維持大鼠核心體溫在36 ℃～37 ℃。假手術(shù)組大鼠除不將尼龍線栓插至大腦中動脈外，其余手術(shù)過程與其它組相同。

1.3 給藥時間和劑量 大鼠MCAO模型制備成功后，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)設(shè)定的不同給藥時間點(diǎn)，通過大鼠尾靜脈給予他侖帕奈(12 mg/kg)注射，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水處理。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 腦梗死體積 每組5只大鼠用于TTC染色，在給藥24 h后斷頭處死大鼠，迅速取腦,去除低位腦干、小腦、嗅球等結(jié)構(gòu)。將腦置于-20 ℃冰箱凍20 min。取出后自額極(Frontal pole)開始,做每間隔1 mm厚度腦冠狀連續(xù)切片。切取完畢后，將腦片放置于37 ℃的2%2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC) (上海精析化工) 0.01 mol PBS 溶液中,孵育25 min，嚴(yán)格避光處理。結(jié)束后在4%多聚甲酸溶液(pH7.4)中固定過夜。采用微距相機(jī)拍攝,獲取圖片，根據(jù)蒼白區(qū)觀察梗死灶范圍，拍攝照片后,用Image-pro plus 6.0軟件對所拍攝的圖像進(jìn)行分析(美國 Media Cybemetics公司)，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算腦梗死體積。腦梗死體積百分比=腦梗死體積/全腦體積，通過計(jì)算腦梗死體積來衡量腦缺血的嚴(yán)重程度。

1.4.2 神經(jīng)功能損傷評分(Longa 評分標(biāo)準(zhǔn)) 0分：活動自如，沒有明顯的神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：提尾時對側(cè)肢體伸展困難，不能完全伸展；2分：爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：爬行時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自主行走，無意識；5分：死亡。所有大鼠均參與神經(jīng)功能損傷評分。

1.4.3 HE染色 利用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)變化。

1.4.4 免疫組化檢測缺血半暗區(qū) caspase-3的表達(dá)及梗死周圍區(qū)的神經(jīng)元 每組5只大鼠用于免疫組化，給藥24 h后，立即處死斷頭取腦,制備石蠟切片，每份組織取4個切片，常規(guī)脫蠟至水,利用POD溶液阻斷，之后用5%的山羊血清封閉,并及時行抗原熱修復(fù),PBS漂洗后依次滴加兔抗鼠單克隆 aspase-3抗體(1∶100,Affinity)，兔抗NeuN抗體(1∶200，Miliipore)，置于4 ℃整夜,使用0.01 PBS漂洗3次，每次10 min，滴加二抗：羊抗兔多克隆抗體(1∶100 北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，于37 ℃保持1.5 h，用PBS 漂洗后進(jìn)行DAB顯色。平均每張切片取5個視野，觀察并計(jì)數(shù)每個視野中表達(dá)caspase-3陽性細(xì)胞及皮質(zhì)存活神經(jīng)元的數(shù)量，并得到平均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死體積及神經(jīng)功能損傷評分結(jié)果 Sham組未出現(xiàn)梗死灶；與Sham組相比，MCAO組及TAL組出現(xiàn)不同程度梗死灶(P<0.05)；與MCAO組相比，TAL0 h、TAL1 h、TAL3 h及TAL5 h組腦梗死體積可見明顯減降低(P<0.05)。TAL5 h組較TAL0 h、TAL1 h、TAL3 h給藥組大鼠腦梗死體積增大(P<0.05)。在TAL組中、TAL0 h、TAL1 h、TAL3 h、TAL5 h時間點(diǎn)的神經(jīng)功能損傷評分均好于MCAO組(P均<0.05，見表1)。

2.2 實(shí)驗(yàn)各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化 大鼠海馬CA1區(qū)，采用HE染色進(jìn)行觀察神經(jīng)元變化，Sham組神經(jīng)元形態(tài)無明顯變化，整齊排列，分布致密，細(xì)胞核圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)透明，核仁清晰可見；而在MCAO組中，大鼠CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)皺縮，變性變化且排列紊亂，組織間出現(xiàn)明顯水腫，胞核出現(xiàn)固縮變化，呈現(xiàn)壞死變化。在TAL組中，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元與MCAO組相比，神經(jīng)元變性壞死的數(shù)量減少，組織水腫及神經(jīng)元形態(tài)變化減輕(見圖1)。

2.3 實(shí)驗(yàn)各組大鼠缺血半暗區(qū)caspase-3的表達(dá)結(jié)果 根據(jù)免疫組化結(jié)果，在Sham組中可見極少量的細(xì)胞caspase-3表達(dá)為陽性(2.00±0.71)，在MCAO組中(80.40±3.85)，在TAL組給藥的各個時間點(diǎn)中caspase-3表達(dá)為陽性的細(xì)胞出現(xiàn)明顯增多。而TAL組各個給藥時間點(diǎn)中細(xì)胞caspase-3表達(dá)為陽性數(shù)量均較MCAO組明顯下降(P<0.05),并且TAL5 h給藥組中(59.80±4.15)與 TAL0 h組(24.60±4.39)、TAL1 h組(32.60±3.36)及TAL3 h組(45.00±6.08)相比，表達(dá)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)增加(見表2、圖2)。

2.4 實(shí)驗(yàn)各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量情況 本實(shí)驗(yàn)利用NeuN免疫組織化學(xué)的方法標(biāo)記皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的細(xì)胞核。根據(jù)免疫組化結(jié)果，Sham組中大鼠腦皮質(zhì)含有大量存活的神經(jīng)元且排列緊密(447.40±13.52)，與Sham組相比，MCAO組 (154.00±10.93)梗死皮質(zhì)區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量明顯降低(P<0.05)，而在TAL組各個給藥時間點(diǎn)大鼠腦皮質(zhì)存活的神經(jīng)元均較MCAO組明顯增高(P<0.05)，且在TAL0 h組(3268.60±11.39)、TAL1 h組(245.60±11.18)及TAL3 h組(219.40±11.91)中尤為明顯(見表2、圖3)。

表1 各組大鼠Longa 評分、腦梗死體積的比較

與Sham組相比△P<0.05；與MCAO組相比*P<0.05；與TAL5 h組相比#P<0.05

表2 各組大鼠腦缺血半暗區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞和腦梗死皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量

與Sham組相比△P<0.05；與MCAO組相比*P<0.05；與TAL5h組相比#P<0.05

3 討 論

興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu受體[12～14]包括代謝型及離子型受體兩大類，離子型受體有3個亞型：AMPA受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid-receptors)、NMDA(N-methyl-D-aspartate receptors)以及KA(kainate receptors,KA)受體。其中AMPA受體屬于化學(xué)-門控性離子通道受體，它由GLUR1、GLUR2、GLUR3和GLUR4 4個亞基組成，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，研究發(fā)現(xiàn)，AMPA受體主要介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞，誘發(fā)突出后電位(excitatory-postsynaptic potential，EPSP)，而AMPA受體的激活不僅可引起長時程抑制(long term depression,LTD)，而且可解除Mg+對神經(jīng)遞質(zhì)與NMDA受體結(jié)合的阻礙而引起Ca2+內(nèi)流增加，觸發(fā)Ca2+依賴的蛋白激酶先關(guān)第二信使，使膜性質(zhì)發(fā)生變化，引起長時程增強(qiáng)效應(yīng)(long-term potentiation，LTP)的產(chǎn)生，引起一系列細(xì)胞病理生理變化，這對神經(jīng)元的整合及可塑性有很重要的影響，其結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性對學(xué)習(xí)、認(rèn)知及記憶等方面具有重要的作用。

同時研究還發(fā)現(xiàn)[15,16]，阻斷谷氨酸受體能夠顯著降低或者抑制癲癇樣活動的發(fā)生，從而減少癲癇樣放電的持續(xù)時間，相比于阻斷NMDA受體，這種效果在阻斷AMPA受體后更為顯著，大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床研究已經(jīng)證實(shí)[17]，AMPA受體在癲癇的同步發(fā)病過程中起到重要的作用，在各種動物模型及體外研究中，都表明AMPA受體可以作為潛在的神經(jīng)保護(hù)作用點(diǎn)，目前其已經(jīng)成為治療癲癇發(fā)病的重要靶點(diǎn)。由于缺血再灌注腦損傷和癲癇發(fā)作密切相關(guān),近年來，一些研究者推測，抗癲癇藥物對缺血再灌注腦損傷同樣是有效的。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈能夠減輕大鼠神經(jīng)功能損傷，減小腦梗死體積，抑制細(xì)胞凋亡，大鼠腦梗死皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量增加，從不同角度反映了他侖帕奈確實(shí)對缺血再灌注腦損傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且在缺血再灌注后前5 h給藥治療效果最佳。

那么這種新型的AMPA非競爭性受體拮抗劑在治療缺血再灌注損傷具體的機(jī)制是什么？許多學(xué)者認(rèn)為，如果能夠干預(yù)興奮性神經(jīng)毒性過程、抑制興奮性級聯(lián)反應(yīng)，可能為缺血再灌注腦損傷治療提供新的思路。在腦部局部供血中斷，局部血流急劇下降，能量供應(yīng)障礙，ATP合成大量減少,Na+-K+-ATP酶活性降低，大量興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸大量釋放，同時再攝取及滅活障礙，使谷氨酸在細(xì)胞間質(zhì)大量積聚，AMPA受體過度激活，而且過度興奮AMPA受體對Na+通透性增高，細(xì)胞膜電位發(fā)生變化，使Ca+、Cl-順著電位差大量內(nèi)流，引起細(xì)胞水腫，大量自由基生成，引起神經(jīng)元急性期及遲發(fā)性損傷甚至死亡[18]。那么他侖帕奈則以AMPA受體為靶點(diǎn)，使神經(jīng)元的興奮性降低，減輕由谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，這可能是他侖帕奈挽救梗死皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)元的主要機(jī)制之一。其次，許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明[19]，他侖帕奈主要作用于AMPA受體亞基家族中(GluR1～4 )GluR2亞單位，其中GluR2決定該受體是否對Ca+具有通透性，其他3種亞單位單獨(dú)或共同存在構(gòu)成的AMPA受體對Ca+具有通透作用，而當(dāng)GluR2存在與其它亞單位共同構(gòu)成受體結(jié)構(gòu)時，那么AMPA受體對Ca+的通透性減低，并具有外向整流的作用，從而穩(wěn)定細(xì)胞膜電位的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞膜去極化作用，而當(dāng)GluR2這一亞單位缺乏時，則會增加Ca+的通透性，引起鈣超載、自由基大量生成、細(xì)胞凋亡等一系列病理生理過程。在分子水平，同樣能夠反映GluR2亞基變化。

近年來，一些動物研究發(fā)現(xiàn)[20,21]，在急性缺血再灌注損傷24 h后，位于缺血再灌注損傷區(qū)特別是大鼠海馬CA1區(qū)GluR2mRNA表達(dá)水平明顯降低，而GluR1、GluR3的mRNA表達(dá)水平卻增加，細(xì)胞膜對Ca+的通透性增加，引起細(xì)胞水腫壞死，同時研究還發(fā)現(xiàn)，若增加AMPA受體各亞基的穩(wěn)定性，阻止各亞基被修飾或調(diào)整，那么神經(jīng)元損傷程度將降低。在AMPA受體4個亞基中，GluR2相比與其它3個亞基在急性缺血損傷后穩(wěn)定性最差，而非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈對GluR2的親和力最強(qiáng)，能夠阻止其在缺血再灌注損傷后被修飾或丟失，從而增加GluR2亞基的穩(wěn)定性，能使Ca+的通透性降低，減少對神經(jīng)元的損害。同時另外一些研究已經(jīng)證明[22]，非競爭性AMPA受體拮抗劑相比與傳統(tǒng)的競爭性受體拮抗劑對神經(jīng)元缺血再灌注損傷具有更好的優(yōu)勢：一方面，其水溶性更高，且能更易通過血腦屏障，對急性缺血再灌注損傷的神經(jīng)元保護(hù)更為有利；另一方面，其不需要與興奮性氨基酸形成競爭關(guān)系，從而阻斷急性缺血再灌注時高濃度的谷氨酸對神經(jīng)元的損傷作用。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，他侖帕奈能夠減少caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)的表達(dá)水平，減少細(xì)胞的凋亡，增加梗死周圍區(qū)神經(jīng)元的存活數(shù)量，對神經(jīng)元缺血再灌注腦損傷有很好的保護(hù)作用，而這與他侖帕奈抑制神經(jīng)元的病態(tài)興奮性密切相關(guān)。

根據(jù)上述：非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈對缺血再灌注腦損傷具有很好的保護(hù)作用，可能與他侖帕奈阻止急性缺血缺氧時高濃度的谷氨酸對AMPA受體的過度激活、抑制神經(jīng)元的病態(tài)興奮性、阻止神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷、減少細(xì)胞凋亡、增加缺血半暗區(qū)神經(jīng)元的存活數(shù)量等有關(guān)。而且本次實(shí)驗(yàn)顯示他侖帕奈的治療作用呈現(xiàn)一定的時間依賴性，隨著時間延長，神經(jīng)保護(hù)作用則會減弱。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(HE×400)

圖2 各組大鼠缺血半影區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(免疫組化×400)

A:Sham組;B:MCAO組;C:TAL0 h;D:TAL1 h組;E:TAL3 h組;F:TAL5 h組

圖3 實(shí)驗(yàn)各組大鼠梗死皮質(zhì)區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量 (免疫組化×200)