方芳,丁爽,吳春玲,段宏梅,劉海娜,肖衛(wèi)國(guó)
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,沈陽(yáng) 110001)
類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis,RA) 是主要累及關(guān)節(jié)的自身免疫性炎癥性疾病,基本病理改變是滑膜炎[1]?;ぜ?xì)胞異常增殖引起關(guān)節(jié)骨、軟骨及軟組織結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受損、受累個(gè)體生活質(zhì)量下降,甚至致殘。除了傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥物,針對(duì)腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interlukin 6,IL-6)等的生物制劑越來(lái)越多應(yīng)用于臨床,進(jìn)而改善骨質(zhì),延緩了關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷[2]。但由于RA疾病本身的異質(zhì)性,現(xiàn)有治療并不都能得到滿意的療效。因此,越來(lái)越多的研究試圖尋找新的治療靶點(diǎn)來(lái)干預(yù)RA的發(fā)病過(guò)程。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白( bone morphogenetic protein,BMP) 屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β( transforming growth factor,TGFβ-) 超家族[3]。除了具有異位成骨能力,還參與胚胎發(fā)育,具有維持組織穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)功能[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BMP-7對(duì)體外培養(yǎng)的RA 成纖維樣滑膜細(xì)胞( fibroblast-like synoviocytes,F(xiàn)LS) 增殖具有促進(jìn)作用,現(xiàn)應(yīng)用Noggin拮抗BMP-7,阻斷BMP-7/Smad通路,觀察RA FLS增殖及炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8 mRNA表達(dá),為進(jìn)一步闡明BMP-7/Smad通路在RA滑膜炎癥調(diào)控中的作用提供依據(jù)。
1.1.1 RA滑膜組織標(biāo)本:滑模標(biāo)本取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院關(guān)節(jié)外科住院行關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)的RA患者的膝關(guān)節(jié)滑膜,診斷符合1987年ACR修訂的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),其中男2例,女1例。標(biāo)本獲取均征得患者本人知情同意。
1.1.2 主要試劑:Recombinant Human Noggin、Recombinant Human BMP-7( 美國(guó)Peprotech公司) ,EliVisionTMplus試劑盒( 福州邁新生物技術(shù)公司) ,PMll640、高糖DMEM培養(yǎng)基、消化用胰酶( 美國(guó)Gibco公司) ,血清( 美國(guó)Hyclone公司) ,Cell CountingKit-8 ( 日本Dojindo公司) ,PCR引物( IL-6 正義鏈,ACCGTCATCATG TCTGACCA;反義鏈,TGGAACACCCTGTCTTTGAC。IL-8 正 義 鏈,ACCGTCATCATGTCTGACCA;反 義鏈,TGGAACACCCTGTCTTTGAC,上海生工公司) ,RNAiso plus、RT-RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。
1.2.1 RA FLS培養(yǎng)與鑒定:將手術(shù)室無(wú)菌獲取的滑膜組織置于含有培養(yǎng)液的無(wú)菌容器中,置于冰盒內(nèi),轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)操作。去除脂肪組織和纖維組織,用磷酸鹽緩沖液( PBS)清洗3~5次,用眼科剪反復(fù)剪切成糊狀,于無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入Ⅱ型膠原酶( 1 mg/mL) ,37 ℃、消化2~4h,過(guò)濾、離心去上清,將細(xì)胞重懸于達(dá)氏修正液( DMEM培養(yǎng)液) ,37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)分裝培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成梭形并成片后,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。RA FLS鑒定采用波形蛋白vimentin及CD68免疫組化法。實(shí)驗(yàn)用3~7代細(xì)胞。
1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):將3~7代RA FLS接種到96孔板中 (1×104/孔) ,共4板,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h,棄培養(yǎng)液;將BMP-7 (終濃度200 ng/mL) 和Noggin (終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μ g/mL) 配置到培養(yǎng)液中,每個(gè)BMP-7濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h后分別取出1個(gè)96孔板,加入20 μ L CCK8試劑,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,置搖床上低速振蕩約10 min,酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm下每孔的吸光度值,然后根據(jù)數(shù)值做增殖曲線。
1.2.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)IL-6、IL-8 mRNA:取BMP-7 (終濃度分別為0、25、50、100、200 ng/mL) 及BMP-7 (終濃度為200 ng/mL) +Noggin (終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μ g/mL) 培養(yǎng)RA FLS 24 h,按照試劑盒操作說(shuō)明分別測(cè)定IL-6、IL-8 mRNA表達(dá),使用ABI RQ manager軟件分析數(shù)據(jù)。
BMP-7 (200 ng/mL) 聯(lián)合Noggin培養(yǎng)RA FLS,隨Noggin濃度增加,BMP-7促進(jìn)RA FLS增殖作用減弱。在 培 養(yǎng)48、72 h,0.4及0.8 μ g/mL Noggin對(duì)RA FLS的增殖抑制作用與對(duì)照組 (Noggin 0 μ g/mL) 比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P < 0.05) ;當(dāng)Noggin濃度為0.8 μ g/mL時(shí),對(duì)增殖的抑制作用最強(qiáng) (P < 0.05) ,見(jiàn)表1。
結(jié)果顯示,BMP-7上調(diào)RA FLS炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8 mRNA表達(dá),且隨濃度上升呈下降趨勢(shì) (P < 0.05) ,見(jiàn)表2。阻斷后,當(dāng)Noggin濃度為0.8 μ g/mL時(shí),能夠較好拮抗BMP-7 (濃度200 ng/mL) ,下調(diào)IL-6、IL-8 mRNA表達(dá),見(jiàn)表3。
BMP作為重要的成骨因子,在各種類(lèi)型的關(guān)節(jié)炎研究中有很多報(bào)道[5]。關(guān)于BMP-7與軟骨細(xì)胞代謝研究[6]發(fā)現(xiàn),BMP-7通過(guò)刺激細(xì)胞外蛋白及受體、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子,同分解代謝有關(guān)的細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝。在關(guān)于RA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]也發(fā)現(xiàn)有BMP/Smad通路活化。同TGF-β相似,BMP信號(hào)通路通過(guò)跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體 (Ⅰ型、Ⅱ型BMP受體) 發(fā)揮作用。BMP二聚體配體與BMPⅠ或Ⅱ型受體結(jié)合,顯著活化下游信號(hào),參與Smad家族成員分子或絲裂原活化蛋白激酶活化過(guò)程[8]。
表1 不同濃度Noggin阻斷BMP-7/Smad通路對(duì)RA FLS增殖的影響Tab.1 Effect of blocking BMP-7/Smad pathway with different concentrations of Noggin on the proliferation of RA FLS
表2 BMP-7 對(duì)RA FLS炎性細(xì)胞因子IL-6 、IL-8 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of BMP-7 on the expression of IL-6 and IL-8 mRNA in RA FLS
表3 不同濃度Noggin對(duì)BMP-7誘導(dǎo)IL-6 、IL-8 mRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effect of different concentrations of Noggin on the expression of IL-6 and IL-8 mRNA induced by BMP-7
BMP信號(hào)通路通過(guò)配體多樣性、細(xì)胞外BMP拮抗劑分泌、I-Smads以及核協(xié)阻遏物和共活化物等在不同水平被調(diào)節(jié)[9-10]。BMP拮抗劑包括Noggin、Chordin、Follistatin、Dan/Cerberus家 族、Gremlin、Dante、Sclerostin和Chordin樣 蛋 白[11]。其 中Noggin是典型的BMP拮抗劑,可阻滯BMP與其相應(yīng)的受體結(jié)合,抑制其信號(hào)傳導(dǎo)通路。在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎 (collagen-induced arthritis,CIA) 鼠關(guān)節(jié)滑膜中,Noggin表達(dá)在0~20 d穩(wěn)定在一定水平,在20 d后逐漸下降[12]。除了關(guān)節(jié)疾病,在其他多種疾?。鄯逝职Y、糖尿病、進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良 (fibrodysplasia ossification progressive,F(xiàn)OP) 、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH) 、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥 (hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT) 、腫瘤]中同樣存在著B(niǎo)MP信號(hào)通路異常。上述疾病研究發(fā)現(xiàn),BMP/Smad通路在維持血管穩(wěn)定性中發(fā)揮作用,并且信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)高度依賴(lài)于其內(nèi)分泌及循環(huán)特性。但關(guān)于BMP及其受體,以及信號(hào)通路在關(guān)節(jié)炎性疾病以及上述疾病中的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。
前期研究[13]發(fā)現(xiàn)RA患者血清中BMP-7水平升高,同疾病活動(dòng)相關(guān),并且體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BMP-7在關(guān)節(jié)炎癥部位高表達(dá),促進(jìn)RA FLS增殖。為了進(jìn)一步研究BMP-7/Smad信號(hào)通路是否參與RA FLS增殖過(guò)程,選擇Noggin作為BMP-7/Smad通路阻斷劑,進(jìn)行信號(hào)通路阻斷的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BMP-7對(duì)RA FLS增殖促進(jìn)作用減弱,并且RA FLS表達(dá)炎性細(xì)胞因子水平降低,提示其發(fā)揮作用可能是通過(guò)阻斷BMP-7/Smad信號(hào)通路。故推測(cè)BMP-7可能是通過(guò)Smad依賴(lài)性通路,促進(jìn)關(guān)節(jié)修復(fù),但其表達(dá)增多可能對(duì)關(guān)節(jié)炎癥有促進(jìn)作用,拮抗其表達(dá)有助于炎癥狀態(tài)的控制。
BMP-7對(duì)炎性細(xì)胞因子雖然有促進(jìn)作用,但同前期研究相比 (TNP-α促進(jìn)RA FLS炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生) ,炎性細(xì)胞因子整體表達(dá)水平偏低,說(shuō)明其促炎作用是有限的。實(shí)驗(yàn)僅研究了體外培養(yǎng)的RA FLS,BMP-7對(duì)RA滑膜中的其他細(xì)胞有怎樣的影響尚不明確,有待進(jìn)一步研究確證。Noggin作為BMP-7拮抗劑,在一定濃度下有可能拮抗BMP-7對(duì)關(guān)節(jié)的破壞作用。雖然目前研究尚不足以證實(shí)單純BMP信號(hào)通路異??烧T發(fā)RA疾病病理過(guò)程,但BMP-7或是其他拮抗劑有可能在關(guān)節(jié)炎癥過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化[14],并通過(guò)Smad通路在RA滑膜炎癥調(diào)控中發(fā)揮作用。靶向BMP-7/Smad信號(hào)通路分子能否成為改善RA患者關(guān)節(jié)炎癥的治療手段,尚需要進(jìn)一步精確的信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。