葛根素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用

吳越，周祖華，聞慶平，苗壯

（1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 大連 116011； 2. 遼寧省軍區(qū)大連第十六離職干部休養(yǎng)所門診部，遼寧 大連 116041）

神經(jīng)病理性疼痛 （neuropathic pain，NP） 是軀體感覺系統(tǒng)損傷或疾病所引起的疼痛，典型癥狀包括自發(fā)性痛、痛覺過敏和痛覺異常［1］。神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子 （IL-1 β、IL-6等）［2-4］，NP與炎癥反應(yīng)有關(guān)，如果能早期抑制炎性細(xì)胞因子釋放，則可能阻止NP產(chǎn)生。

葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類化合物，化學(xué)名8-D-葡萄吡喃糖-4’，7-二羥基異黃酮［5-6］。葛根素對(duì)于治療腦血管疾病具有一定效果，能夠改善微循環(huán)，可用于治療腦缺血再灌注引起的腦損傷，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞損傷都具有保護(hù)作用［7］。相關(guān)研究［8］表明，葛根素能夠緩解NP，作用半衰期長(zhǎng)，需要的劑量小。本研究探討葛根素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié) （dorsal root ganglion，DRG） NP的鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)DRG中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組

選用24只雄性SD大鼠 （大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供） ，體質(zhì)量200～220 g。隨機(jī)均分為3組 （n = 8） ：脊神經(jīng)結(jié)扎 （spinal nerve ligation，SNL ） 組 （SNL組，僅行脊神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)） 、 Pue組 （行SNL手術(shù)并鞘內(nèi)注射葛根素 （10 μ g/mL） ］、假手術(shù)組（Sham組，不結(jié)扎脊神經(jīng)，其他手術(shù)步驟同SNL組） 。所用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)和使用委員會(huì)的要求。葛根素 （美國Sigma Aldrich公司，CAS編號(hào)：3681-99-0） 溶于生理鹽水配置成10 μ g/mL濃度溶液供鞘內(nèi)注射應(yīng)用。

1.2 方法

1.2.1 鞘內(nèi)置管：水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，手術(shù)分離暴露右側(cè)L5椎板，將PE-10導(dǎo)管經(jīng)L4和L5椎間隙向上置入，深度為2 cm，固定于皮下筋膜處，從頸部將導(dǎo)管遠(yuǎn)端引出，留約2 cm再固定。術(shù)后第5天經(jīng)導(dǎo)管注射20 μ L2%利多卡因，大鼠在隨后的30 s內(nèi)如果出現(xiàn)雙腿麻痹則證明鞘內(nèi)置管成功，隨后單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 SNL模型制備：將鞘內(nèi)置管成功的大鼠隨機(jī)分為3組，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，用電動(dòng)剃刀將腰背部鼠毛清理干凈，對(duì)皮膚進(jìn)行消毒處理，切開手術(shù)區(qū)域皮膚暴露出脊椎，用咬骨鉗咬斷右側(cè)L5橫突，用手術(shù)絲線結(jié)扎L5和L6神經(jīng)，最后縫合肌肉與皮膚。 Sham組大鼠的手術(shù)操作步驟與SNL手術(shù)相同，但只暴露脊神經(jīng)而不結(jié)扎。Pue組大鼠進(jìn)行SNL手術(shù)同時(shí)，鞘內(nèi)注射10 μ L葛根素 （10 μ g/mL） 。1.2.3 大鼠機(jī)械縮足反應(yīng)閾值 （mechanical withdrawal thresholds，MWT） 測(cè)定：使用電子 von-Frey測(cè)痛儀 （美國IITC Life Science公司） 直徑為200 μ m的Von Frey絲刺激大鼠的右側(cè)后足，觀察大鼠后足的縮腿反應(yīng)，用MWT （g） 表示大鼠對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng)的疼痛程度。 將大鼠置于1個(gè)四面透明無底的有機(jī)玻璃架 （10 cm×10 cm×15 cm） 中，在有機(jī)玻璃架下面放一個(gè)金屬網(wǎng)架子，實(shí)驗(yàn)開始前讓大鼠在有機(jī)玻璃盒中適應(yīng)30 min，穿過金屬網(wǎng)眼將Von Frey 絲垂直刺向大鼠足底，當(dāng)大鼠后足出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，每次刺激間隔時(shí)間為5 min，重復(fù)測(cè)量6次后取平均值。

1.2.4 大鼠熱縮足潛伏期 （thermal withdrawal lantency，TWL） 測(cè)定：通過檢測(cè)大鼠后足底對(duì)熱刺激產(chǎn)生的TWL （s） 來衡量熱痛閾值。把待檢測(cè)大鼠單獨(dú)放置于透明玻璃籠 （20 cm×20 cm×40 cm） 中，適應(yīng)環(huán)境30 min后，使用熱輻射疼痛刺激器 （BME-410C，天津伯爾尼科技有限公司） 在玻璃籠下方固定距離聚焦大鼠后足底，當(dāng)大鼠產(chǎn)生縮足或舔足停止照射，記錄照射起止時(shí)間。每次刺激的間隔時(shí)間為10 min，每只大鼠重復(fù)測(cè)量5次后取平均值，設(shè)置最高閾值為20 s。

1.2.5 Western blotting 檢測(cè)DRG神經(jīng)元中IL-1 β和IL-6表達(dá)：SNL手術(shù)后，大鼠術(shù)側(cè)足術(shù)后1～10 d痛閾值呈現(xiàn)穩(wěn)步下降趨勢(shì)［9］。實(shí)驗(yàn)所用蛋白取自術(shù)后7 d每組4只實(shí)驗(yàn)大鼠L5和L6的DRG，保存在液氮中。每個(gè)樣品總蛋白25 μ g，配置5%的積成膠和10%的分離膠；先80 V電壓電泳30 min，然后換電壓為120 V電泳1 h；在4 ℃冰盒中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1 h到PVDF膜上，用TBST洗膜，共洗3次，每次5 min；然后用5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，接著用一抗IL-1 β （美國Cell Signaling Technology公司，#12242） 和IL-6抗體 （美國Cell Signaling Technology公司，#12912） ，抗體稀釋濃度為1∶1 000，4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗3次，每次5 min，之后應(yīng)用二抗 （1∶3 000） 室溫孵育1 h，使用發(fā)光試劑盒 （中國天能公司） 檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。所有實(shí)驗(yàn)均使用等量蛋白進(jìn)行GAPDH抗體 （1∶3 000） 檢測(cè)。蛋白條帶灰度值用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 ELISA檢測(cè)DRG中IL-1 β和IL-6表達(dá)：將每組4只大鼠麻醉后，迅速取L5和L6背根神經(jīng)節(jié) （DRG）［9］。將DRG用玻璃勻漿器制成勻漿，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，將濃度統(tǒng)一為1 μ g/μ L。按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定炎性細(xì)胞因子IL-1 β以及IL-6含量。先用洗滌液 （300 μ L/孔） 清洗酶標(biāo)孔中，重復(fù)5次。每孔加入100 μ L標(biāo)準(zhǔn)品、樣品；室溫下孵育2 h。洗板5次。加入提前配好的抗體工作液 （100 μ L /孔） ，室溫下用搖床 （100 r/min） 孵育1 h。洗板5次。隨后加入提前配好的酶結(jié)合物工作液 （100 μ L/孔） ，室溫下用搖床（100 r/min） 孵育0.5 h。洗板5次。加顯色劑 （TMB，100 μ L/孔） ，室溫下反應(yīng)，避光顯色15 min，顏色為藍(lán)色。加終止液 （100 μ L/孔） ，輕輕混勻呈黃色，在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè) （450 nm為主波長(zhǎng)，570 nm或630 nm為參考波長(zhǎng)） 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MWT比較

結(jié)果顯示，大鼠在SNL手術(shù)前對(duì)機(jī)械刺激縮腿反應(yīng)的基礎(chǔ)閾值是20.5 g。與Sham組比較，SNL組大鼠MWT明顯降低 （P ＜ 0.01） ，并表現(xiàn)為時(shí)間依賴性，手術(shù)后1、3、5、7 d后持續(xù)降低。與SNL組比較，Pue組大鼠除第1天外，其他時(shí)間點(diǎn)MWT明顯升高 （P ＜0.05） ，見表1。

2.2 各組大鼠TWL比較

各組大鼠術(shù)前1 d時(shí)TWL比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＞ 0.05） 。與Sham組比較，SNL組、Pue組術(shù)后5、7 d TWL均降低（ P ＜ 0.05） ，與SNL組比較，術(shù)后5、7 d Pue組TWL升高（ P ＜ 0.05） ，見表2。

2.3 Western blotting檢測(cè)各組大鼠DRG中IL-1 β、IL-6蛋白表達(dá)

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間MWT比較 （g，）Tab.1 Comparison of mechanical withdrawal thresholds in three groups of rats after surgery （g，）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間MWT比較 （g，）Tab.1 Comparison of mechanical withdrawal thresholds in three groups of rats after surgery （g，）

1） P ＜ 0.05 vs Sham group；2） P ＜ 0.05 vs SNL group.

Group n Mechanical withdraw thresholds after surgery 1 d 3 d 5 d 7 d Sham 8 20.90±2.8 17.79±3.5 20.90±2.8 17.79±3.5 SNL 8 10.21±2.81） 7.55±1.21） 3.02±0.61） 2.40±0.31）Pue 8 10.60±1.21） 8.10±1.21） 5.84±0.41），2） 4.85±0.61），2）

表2 術(shù)后各組大鼠不同時(shí)間TWL比較 （s，）Tab.2 Comparison of thermal withdrawal latencies in three groups of rats after surgery （s，）

表2 術(shù)后各組大鼠不同時(shí)間TWL比較 （s，）Tab.2 Comparison of thermal withdrawal latencies in three groups of rats after surgery （s，）

1） P ＜ 0.05 vs Sham group；2） P ＜ 0.05 vs SNL group.

Group Thermal withdrawal lantencys after surgery 1 d 3 d 5 d 7 d Sham 11.33±0.7 11.33±0.7 12.11±0.8 11.67±0.6 SNL 10.22±0.3 10.27±0.2 10.27±0.21） 8.16±0.31）Pue 12.08±0.6 11.51±0.4 11.14±0.22） 10.81±0.42）

結(jié)果顯示，Sham組大鼠DRG組織中IL-1 β和IL-6表達(dá)很低。與Sham組比較，SNL組 IL-1 β和IL-6表達(dá)明顯增加 （P ＜ 0.01） ；Pue組與SNL組比較IL-1 β和IL-6明顯降低 （P ＜ 0.05） ，見圖1。

2.4 ELISA檢測(cè)各組大鼠DRG中IL-1 β、IL-6水平比較

圖1 術(shù)后7 d各組大鼠DRG中IL-1 β、IL-6蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of IL-1 β and IL-6 proteins in the dorsal root ganglion of rats，7 days after surgery in each group

結(jié)果顯示，與Sham組比較，SNL組IL-1 β、IL-6表達(dá)升高 （P ＜ 0.05） ；與SNL組比較，Pue組IL-1 β、IL-6表達(dá)降低 （P ＜ 0.05） 。

表3 術(shù)后7 d各組大鼠DRG中IL-1 β、IL-6蛋白表達(dá)比較 （，pg/mg）Tab.3 Expression of IL-1 β and IL-6 protein in the dorsal root ganglion of rats，7 days after surgery in each group（，pg/mg）

表3 術(shù)后7 d各組大鼠DRG中IL-1 β、IL-6蛋白表達(dá)比較 （，pg/mg）Tab.3 Expression of IL-1 β and IL-6 protein in the dorsal root ganglion of rats，7 days after surgery in each group（，pg/mg）

1） P ＜ 0.05 vs Sham group；2） P ＜ 0.05 vs SNL group.

Group IL-1 β protein IL-6 protein Sham 128.30±15.4 112.58±25.8 SNL 335.24±21.61） 452.28±46.51）Pue 178.58±16.82） 230.28±36.62）

3 討論

有研究［10］發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠阻斷Na+通道，通過抑制TTX-R鈉電流的激活進(jìn)而減少大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞鈉離子電流。葛根素能夠抑制大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞P2X3的表達(dá)，對(duì)急性燒傷疼痛大鼠模型發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［11］。本實(shí)驗(yàn)所采用的SNL模型是NP發(fā)病機(jī)制研究的常用動(dòng)物模型，研究結(jié)果表明模型制備成功，手術(shù)后大鼠出現(xiàn)了顯著的機(jī)械性痛覺超敏和熱痛覺過敏；SNL大鼠持續(xù)注射葛根素可減輕因神經(jīng)損傷所引起的機(jī)械性痛覺超敏和熱痛覺過敏，并在第7天停藥后鎮(zhèn)痛作用持續(xù)存在。與Sham組比較SNL大鼠術(shù)后DRG炎性細(xì)胞因子表達(dá)明顯升高，在持續(xù)鞘內(nèi)注射葛根素7 d后炎性細(xì)胞因子明顯下降，表明葛根素可抑制NP所引起的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在CFA誘導(dǎo)的慢性炎癥動(dòng)物模型中，葛根素通過抑制前炎性細(xì)胞因子來緩解炎癥痛［12］。在大鼠慢性壓迫損傷模型中，葛根素通過抑制脊髓的神經(jīng)炎癥緩解神經(jīng)病理性疼痛［13］，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，鞘內(nèi)注射葛根素可緩解大鼠SNL所致NP，并通過下調(diào)DRG中炎性細(xì)胞因子IL-1 β以及IL-6的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)NP具有鎮(zhèn)痛作用。本研究未對(duì)葛根素抑制炎性細(xì)胞因子的機(jī)制進(jìn)行探討，推測(cè)葛根素抗NP的作用可能與其抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)而減少炎性細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)，其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。