血管緊張素Ⅱ2型受體對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥血管生成的影響

張真真，戴姝艷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

子宮內(nèi)膜異位癥 （endometriosis，EMs） 是育齡期婦女的常見(jiàn)疾病，指子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在宮腔以外的身體其他組織而引起的一種疾病，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，可達(dá)10%～15%。EMs所引起的痛經(jīng)、下腹痛和性交痛等，嚴(yán)重影響婦女的健康和生活質(zhì)量［1］，EMs雖為良性病變，但具有類(lèi)似惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和種植侵襲能力［2-3］，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年來(lái)對(duì)EMs發(fā)病機(jī)制的研究［4］表明，異位病灶的發(fā)生與發(fā)展必須有新生血管的建立才能得以維持。血管緊張素被證實(shí)是促進(jìn)生理性及病理性血管生成的重要因子，主要通過(guò)與AT1、 AT2結(jié)合，發(fā)揮生理作用。研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)血管緊張素Ⅱ2型受體 （angiotensinⅡtype 2 receptor，AT2R） 對(duì)高血壓、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展有抑制作用，提示AT2R可能在疾病病程中發(fā)揮保護(hù)性作用，但目前AT2R在EMs中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析AT2R對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位結(jié)節(jié)血管形成的影響，來(lái)探討AT2R在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)雌性、清潔、性成熟、未孕SD大鼠45只，體質(zhì)量 （180±20） g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號(hào)：SCXK （京） 2014-0004，倫理編號(hào)：2016PS320K，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪實(shí)驗(yàn)基地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20%～25%，濕度50%～70%，照明周期為12/12 h，自由食水，保持墊料干燥，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

CGP42112A購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；氯沙坦購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)公司；大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α） ELISA試劑盒、微血管染色所用的兔抗鼠CD34多克隆抗體均購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 大鼠EMs模型的建立：Vernon自體移植法［7］建立大鼠EMs模型，4周后開(kāi)腹，造模成功大鼠可見(jiàn)移植物內(nèi)出現(xiàn)液體積聚 （積液高度≥2 mm） ，呈隆起透亮的小囊泡，被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成，清晰可見(jiàn)，通常與周?chē)M織粘連緊密，故視為造模成功［8］。

1.2.2 模型組大鼠分組：選取建模成功的30只模型大鼠，隨機(jī)分為AT2R激動(dòng)劑CGP42112A低劑量組 （5 μ g·kg-1·d-1） 、中劑量組 （15 μ g·kg-1·d-1） 、高劑量組 （30 μ g·kg-1·d-1） 、AT1R阻滯劑氯沙坦組 （10 mg·kg-1·d-1） ，安慰劑對(duì)照組 （無(wú)菌注射用水） ，每組6只成模大鼠。各組按劑量每天腹腔注射給藥1次（氯沙坦灌胃） ，連續(xù)4周。

1.2.3 標(biāo)本的收集：各組相應(yīng)處理4周后，麻醉大鼠開(kāi)腹，取腹主動(dòng)脈血，以3 000 r/min離心15 min，取血清分裝，于-80 ℃保存。分離周?chē)尺B組織，觀察異位結(jié)節(jié)大體形態(tài)并記錄，用游標(biāo)卡尺測(cè)量異位結(jié)節(jié)大小，根據(jù)公式體積 （mm3） =0.52×長(zhǎng)×寬×高［9］，記錄各組處理后異位結(jié)節(jié)體積。同時(shí)留取異位結(jié)節(jié)，置于10%中性甲醛溶液中固定，常溫固定24 h后常規(guī)石蠟包埋，4 μ m厚度連續(xù)切片。

1.2.4 標(biāo)本檢測(cè)：

1.2.4.1 病灶體積 取下病灶組織，游標(biāo)卡尺測(cè)量移植物的長(zhǎng)、寬、高，計(jì)算移植物體積，體積 （mm3） =0.52×長(zhǎng)×寬×高，并再次記錄。

1.2.4.2 免疫組化法計(jì)數(shù)微血管密度（microvessel density，MVD） 采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物 （strept avidin-biotin complex，SABC） 法測(cè)定，以兔抗鼠CD34多克隆抗體染色的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，參照Weidner 微血管計(jì)數(shù)方法，在低倍鏡視野 （10倍） 下選取微血管密集度區(qū)，然后在高倍鏡視野下 （40倍） 計(jì)數(shù)所有的微血管，選取最大3個(gè)數(shù)值的平均數(shù)作為該例的MVD。

1.2.4.3 ELISA法檢測(cè)血清中VEGF及 TNF-α的含量采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)，操作方法參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用酶標(biāo)儀得到吸光度OD值，再運(yùn)用CVXPT 32軟件包計(jì)算出濃度值，得到大鼠血清VEGF和TNF-α的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以描述，多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMs模型建立情況

45只大鼠造模成功34只 （成功率75%） ，成模大鼠可見(jiàn)異位結(jié)節(jié)，個(gè)別大網(wǎng)膜粘連，腹壁可見(jiàn)異位病灶，呈充滿(mǎn)透明液體的透亮小囊泡，表面可見(jiàn)豐富血管走行，見(jiàn)圖1。

2.2 成模大鼠分組用藥后病灶體積比較

圖1 大鼠EMs模型Fig.1 The model of rat endometriosis

肉眼見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠用藥后異位結(jié)節(jié)體積出現(xiàn)不同程度縮小，表面新生血管明顯減少，見(jiàn)圖2。高劑量組有2只大鼠異位結(jié)節(jié)萎縮，移植處僅見(jiàn)灰白色瘢痕組織。對(duì)照組異位灶體積無(wú)明顯改變。處理后中、高劑量組及氯沙坦組異位結(jié)節(jié)體積較安慰劑對(duì)照組明顯縮小 （P ＜ 0.01） ，低劑量組和安慰劑對(duì)照組間比較無(wú)明顯改變 （P ＞ 0.05） 。中、高劑量組與氯沙坦組異位結(jié)節(jié)體積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05） ，表明ATR2對(duì)異位結(jié)節(jié)體積的影響呈劑量依賴(lài)性改變，見(jiàn)表1。

圖2 各組用藥處理后異位結(jié)節(jié)體積比較Fig.2 Representative images of endometriotic lesions in each group

表1 各組藥物處理后異位灶體積及MVD的比較 （±s，n = 6）Tab.1 Comparison of the volume and MVD in the rats in the different groups after treatment （，n = 6）

表1 各組藥物處理后異位灶體積及MVD的比較 （±s，n = 6）Tab.1 Comparison of the volume and MVD in the rats in the different groups after treatment （，n = 6）

1） P ＜ 0.05 vs control group；2） P ＜ 0.01 vs control group.

Parameter Control group Losartan group CGP42112A group Low-dose Middle-dose High-dose Volume 64.03±9.40 8.01±1.33 43.68±6.50 9.02±1.421） 8.82±1.391）MVD 33.66±1.23 11.94±0.75 27.27±1.99 14.83±0.612） 11.61±0.802）

2.3 AT2R對(duì)異位組織MVD值的影響

實(shí)驗(yàn)各組MVD較對(duì)照組明顯降低 （P ＜ 0.01） ，低劑量組和對(duì)照組間比較無(wú)明顯差異 （P ＞ 0.05） 。中、高劑量組與低劑量組及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.01）；高劑量組與中劑量組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；高劑量組及氯沙坦組MVD無(wú)明顯改變 （P ＞ 0.05） ，表明ATR2對(duì)MVD的影響呈劑量依賴(lài)性改變，見(jiàn)表1。

2.4 AT2R對(duì)血清VEGF、TNF-α表達(dá)的影響

處理后中、高劑量組治療后大鼠血清VEGF、TNF-α平均濃度較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。高劑量組與中劑量組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，表明ATR2對(duì)VEGF、TNF-α的影響在一定程度上也呈劑量依賴(lài)性改變，見(jiàn)表2。

3 討論

雖然EMs的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確［10］，但多個(gè)研究［11-12］結(jié)果表明其與血管再生及血管生成有密切關(guān)系，EMs病灶的種植、侵襲和生長(zhǎng)關(guān)鍵在于新生血管生成來(lái)維持血液供應(yīng)［13］，從而促成EMs發(fā)病且反復(fù)發(fā)作。異位病灶內(nèi)部和周?chē)写罅刻卣餍缘男律?，腹腔局部的血管生成活躍，本研究建立的大鼠EMs模型已充分證實(shí)這一點(diǎn)。因此通過(guò)抑制異位病灶血管生成來(lái)治療EMs已成為此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

表2 各組藥物處理后VEGF和TNF-α的濃度比較 （，pg/mL）Tab.2 Comparison of VEGF and TNF-α levels in the rats in the different groups after treatment （，pg/mL）

表2 各組藥物處理后VEGF和TNF-α的濃度比較 （，pg/mL）Tab.2 Comparison of VEGF and TNF-α levels in the rats in the different groups after treatment （，pg/mL）

1） P ＜ 0.01 vs control group；2） P ＜ 0.05 vs control group.

Parameter Control group Losartan group CGP42112A group Low-dose Middle-dose High-dose TNF-α 122.51±9.98 15.95±2.15 101.36±5.90 88.38±9.631） 38.53±5.052）VEGF 10.53±10.00 8.76±1.35 52.68±4.11 40.44±8.452） 17.33±1.881）

血管緊張素Ⅱ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要效應(yīng)器，是一種調(diào)節(jié)系統(tǒng)血壓以及體液和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)［14］，且已被證實(shí)存在于子宮內(nèi)膜組織中［15］，參與子宮內(nèi)膜的周期性變化及生殖功能的調(diào)節(jié)、維持妊娠期人體子宮穩(wěn)態(tài)等一系列生理過(guò)程；并參與功能性子宮內(nèi)膜出血、EMs、婦科腫瘤等病理生理過(guò)程［16］。血管緊張素Ⅱ被證實(shí)是促進(jìn)生理性及病理性血管生成的重要因子［17］，主要與AT1R、AT2R結(jié)合發(fā)揮作用，AT1R廣泛表達(dá)于血管組織，血管緊張素Ⅱ的大部分作用都是AT1R介導(dǎo)的，而AT2R在成人體內(nèi)低密度表達(dá)，主要表達(dá)于內(nèi)皮、血管平滑肌和神經(jīng)元細(xì)胞等［18］，且兩者作用在某些方面相反［19］，AT1R會(huì)提高醛固酮及血管加壓素的水平，促進(jìn)血管生成，增加血管阻力［20］，而AT2R的主要功能是血管舒張，抑制細(xì)胞增殖，并觸發(fā)緩激肽和硝酸鹽氧化物的釋放［21-22］。研究［23］發(fā)現(xiàn)，AT1R和AT2R均表達(dá)于EMs，且AT1/AT2 mRNA在EMs中的表達(dá)顯著高于非EMs的正常增生性子宮內(nèi)膜。進(jìn)一步研究［24］表明，激活的AT2R能通過(guò)與AT1R結(jié)合形成異質(zhì)二聚物來(lái)直接對(duì)抗AT1R介導(dǎo)的生理及病理效應(yīng)。自1994年第1個(gè)AT1R拮抗劑氯沙坦上市后，越來(lái)越多的AT1R拮抗劑被廣泛應(yīng)用于臨床，研究［25-26］發(fā)現(xiàn)，AT1R阻滯劑如氯沙坦能夠通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)抑制血管生成，并且有可能抑制前列腺癌、乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌的生長(zhǎng)。替米沙坦能夠抑制血管生成，減少免疫細(xì)胞數(shù)量，抑制大鼠子宮內(nèi)膜異位結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)［27］且氯沙坦也在大鼠EMs試驗(yàn)中證實(shí)了這一點(diǎn)［28］。

有研究發(fā)現(xiàn)在EMs囊腫中AT2R的表達(dá)可以抑制AT1R的表達(dá)。換而言之，激動(dòng)AT2R可能對(duì)EMs新生血管的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。為探明AT2R在EMs中對(duì)新血管形成的影響及作用，本研究通過(guò)Vernon法建立大鼠EMs模型，給予AT2R激動(dòng)劑CGP42112A，并同時(shí)設(shè)立AT1R拮抗劑氯沙坦作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察其對(duì)EMs微血管形成的影響。結(jié)果顯示，AT2R激動(dòng)劑與生理鹽水對(duì)照組比較，大鼠異位病灶的體積明顯縮小，還能抑制異位灶中MVD的數(shù)量和血清中VEGF、TNF-α的表達(dá)，且此種效應(yīng)有明顯地劑量依賴(lài)性，中高劑量組比低劑量組抑制血管生成的作用更加顯著。CGP42112A與AT1R拮抗劑氯沙坦作用一致，均有明顯的抑制異位病灶血管生成及縮小病灶體積的作用，且此作用可能與抑制VEGF、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。由此可見(jiàn)，AT2R在EMs的藥物治療中有著廣泛的前景。但是參與血管生成的因子很多，且為一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，AT2R是否對(duì)其他血管生成因子也有作用以及這些血管生成因子之間的相互關(guān)系都有待深入研究。此外，AT2R對(duì)于EMs是否具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、止痛、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能等作用，有待進(jìn)一步研究，從而為臨床治療EMs提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，為開(kāi)發(fā)治療藥物提供新的靶點(diǎn)。